Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej
- Pozyskać ludzką krew pełną od zdrowego dawcy lub pacjenta przez nakłucie żyły za pomocą podgrzewaczy próżniowych zawierających antykoagulant kwasowo-cytrynianowo-dekstrozowy (ACD) (probówki z żółtą górą).
nuta: Krew pełna może być przechowywana w ACD w temperaturze pokojowej (18-22 °C) do 36 godzin przed przejściem do następnego etapu. Zwykle do testu wystarczają 1-2 probówki próżniowe o pojemności 10 ml z krwią pełną.
- Rozcieńczyć krew pełną w stosunku 1:1 v/v w ciepłym, kompletnym pożywce RPMI (RPMI-1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą, 20 mM HEPS i 0,01 mg/ml gentamycyny).
- Wyizolować jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) z rozcieńczonej krwi pełnej za pomocą wirowania w gradiencie gęstości, zgodnie z zaleceniami producenta (patrz wykaz materiałów). Rozcieńczoną krew należy bardzo powoli nakładać na gradient gęstości (podgrzanej do temperatury pokojowej, 18-22 °C).
nuta: Zminimalizuj ilość mieszania na granicy faz w celu optymalnego oddzielenia krwi, ostrożnie nakładając mieszaninę krwi kroplami lub używając pipety.
- Pozwolić, aby mieszanina krwi powoli nakładała się na górną część gradientu gęstości, umieszczając końcówkę pipety blisko gradientu gęstości i pozwalając mieszaninie krwi spływać po boku probówki bardzo powoli.
- W zależności od skali eksperymentu, ułóż 10 ml mieszaniny krwi na 3 ml gradientu gęstości (w probówce 15 ml) lub warstwę 35 ml mieszaniny krwi na 15 ml gradientu gęstości (w probówce 50 ml). Zazwyczaj 10 ml krwi pełnej daje 10 milionów PBMC, z pewnymi różnicami między dawcami.
nuta: Bardzo ważne jest, aby nie dochodziło do mieszania się mieszaniny krwi z gradientem gęstości. Mieszanina krwi powinna nakładać się na gradient gęstości i powoli rosnąć, aż cała krew znajdzie się na szczycie gradientu gęstości.
- Odwirować warstwową mieszaninę o sile 700 x g przez 30 minut bez hamulców. Odwirowaną mieszaninę należy podzielić na 5 warstw (od góry do dołu): osocze, kożuchowy płaszcz (zawierający PBMC), materiał gradientu gęstości, granulocyty i erytrocyty.
- Usuń i wyrzuć większość osocza, a następnie ostrożnie odzyskaj zawartość kożucha (PBMC) do nowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą pipety Pasteura i bańki ssącej.
nuta: Usuwanie warstwy kożucha odbywa się skutecznie poprzez zastosowanie ssania na pipecie Pasteura, wykonując jednocześnie okrężne ruchy wokół zewnętrznej strony warstwy, z końcówką pipety przylegającą do rurki.
- Przemyć wyizolowane PBMC trzykrotnie w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,3 (PBS) przez odwirowanie przy 350 x g przez 10 minut (z pełnymi hamulcami) pomiędzy płukaniami. Rozpuść osad PBMC w kompletnym podłożu RPMI. W zależności od wielkości granulki wystarczy 3-7 ml podłoża.
- Policz PBMC za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru. Policz tylko te komórki, które nie są zabarwione błękitem trypanowym. Rozpuść PBMC do 1 750 000 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI.
- Wysiewaj 400 μl (700 000 komórek) do każdego dołka 8-komorowego szkiełka. Inkubować szkiełko w całkowicie nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C (uzupełnionym 5% CO2 ) przez 1 godzinę, aby umożliwić przyleganie monocytów/makrofagów.
2. Wstępne leczenie przylegających monocytów
UWAGA: Ten krok jest konieczny tylko wtedy, gdy szukasz sposobów na zahamowanie lub wzmocnienie fagocytozy.
- Wstępnie potraktuj przylegające monocyty dowolnymi lekami lub związkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Rozpuścić lek(i) lub inny badany materiał do pożądanego stężenia, używając kompletnego podłoża RPMI.
nuta: Na przykład 200 μg/ml IVIG jest zwykle używane do uzyskania 95-100% zahamowania fagocytozy przy użyciu ludzkich monocytów.
- Odessać i odrzucić supernatant zawierający jakiekolwiek nieprzylegające komórki z 8-komorowego szkiełka po 1-godzinnej inkubacji (po kroku 1.6). Zastąpić go 400 μl leku lub innego środka leczniczego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
- Podczas zasysania i wymiany roztworów w szkiełku 8-komorowym należy pamiętać o kontrolowaniu przepływu płynów, aby słabo przylegające komórki nie unosiły się. Pracuj również tylko z 2-3 pustymi studzienkami na raz i unikaj suszenia studzienek.
nuta: Zazwyczaj każdy zabieg wykonywany jest w trzech egzemplarzach technicznych.
3. Opsonizacja czerwonych krwinek R2R2
UWAGA: Opsonizowane RBC R2R2 są używane jako kontrola pozytywna dla fagocytozy za pośrednictwem FcγR. Naiwny R2R2 należy przechowywać w roztworze Alsever (w celu przedłużenia okresu przydatności do spożycia) w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca. Roztwór firmy Alsever jest wytwarzany we własnym zakresie i składa się z 0,8% m/v cytrynianu trisodowego (dwuwodnego), 1,9% w/v dekstrozy, 0,42% w/v chlorku sodu i 0,05% w/v kwasu cytrynowego (jednowodnego). Jeśli komórki R2R2 nie są dostępne, można użyć innych komórek Rh-fenotypowanych, takich jak R1R2, R1R1, R1r lub R2r.
- Przemyć krwinki czerwone R2R2 (cDE/cDE) w PBS łącznie trzy razy, używając wirowania przy 350 x g przez 5 minut każda.
nuta: Ilość potrzebnych erytrocytów zależy od wielkości eksperymentu i może być obliczona wstecznie. Zawsze należy przemyć nadmiar krwinek czerwonych, ponieważ są one tracone podczas każdego prania w wyniku lizy lub podczas usuwania supernatantu. Na przykład w eksperymencie z 5 zabiegami i 2 kontrolami, przeprowadzonymi w trzech próbach technicznych, jest w sumie 21 studzienek. 21 dołków z 400 μl / studzienka 1,25% mieszaniny RBC wskazuje, że potrzebne jest 105 μl upakowanych, opsonizowanych RBC. 200 μl RBC należy wstępnie przepłukać, a 150 μL opsonizować, aby upewnić się, że jest odpowiednia ilość RBC na etapie fagocytozy.
- Opsonizować przemyty osad R2R2 poliklonalnymi przeciwciałami anty-D 1:1 v/v z ludzkiej surowicy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, z przerywanym mieszaniem.
nuta: Jeśli poliklonalne przeciwciała anty-D nie są dostępne, możliwe jest użycie przeciwciał monoklonalnych anty-D, które są dostępne na rynku, lub przeciwciał anty-D, które są zwykle stosowane w profilaktyce immunologicznej Rh, które można uzyskać w bankach krwi lub usługach transfuzjologicznych. Testy optymalizacyjne należy przeprowadzić na początku podczas ustawiania testu oraz za każdym razem, gdy zmienia się partie przeciwciał poliklonalnych bez ograniczenia lub przechodzi na przeciwciało monoklonalne. Ma to na celu określenie optymalnego stężenia lub objętości anty-D wymaganej do uzyskania wyniku testu antyglobulinowego (IAT) między 3+ a 4+ oraz wyniku fagocytozy między 70-90 fagocytozowanych erytrocytów na 100 zliczonych monocytów.
- Przemyć opsonizowane R2R2 łącznie trzy razy w PBS, odwirowując przy 350 x g przez 5 minut każdy.
nuta: Pomyślną opsonizację R2R2 można potwierdzić wykonując pośrednie IAT. Krótko mówiąc, dodaje się drugorzędowe poliklonalne przeciwciała anty-ludzkie w celu związania pierwszorzędowych przeciwciał opsonizujących na powierzchniach RBC, a wzmocniony sygnał można zaobserwować w postaci hemaglutynacji. Szczegółowy protokół producenta znajduje się w pliku materiałów uzupełniających.
- Rozpuść przemyty osad R2R2 do 1,25% v/v przy użyciu kompletnego podłoża RPMI.
nuta: Nadmiar opsonizowanego R2R2 może być przechowywany w roztworze Alsevera w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia.
4. Fagocytoza za pośrednictwem receptora Fc
- Odessać lek lub pożywkę supernatant z szkiełka 8-komorowego i dodać 400 μl mieszaniny 1,25% v/v R2R2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
- Po 2 godzinach inkubacji wyjmij komory za pomocą adapterów producenta. Zetrzyj nadmiar R2R2 na ręczniku papierowym. Upewnij się, że szkiełko nie wysycha.
- Napełnij zlewkę o pojemności 100 ml PBS. Zanurz i umyj szkiełko, powoli przesuwając szkiełko do przodu i do tyłu (około 30-40 ruchów), aby usunąć większość niefagocytozowanego R2R2.
- Wyjmij szkiełko z PBS. Zetrzyj nadmiar PBS za pomocą ręcznika papierowego lub chusteczki i wysusz szkiełko na powietrzu.
- Zamocuj wysuszoną na powietrzu szkiełko w 100% metanolu na 45 s. Następnie wysusz na powietrzu zamocowaną prowadnicę.
nuta: Szkiełka można mocować za pomocą innej metody, która jest bardziej kompatybilna z późniejszym barwieniem, takiej jak bejca Grünwald-Giemsa21 lub bejca Wright-Giemsa.
- Zamontuj szkiełko za pomocą własnego podłoża montażowego Elvanol (lub innego dostępnego na rynku podłoża montażowego) i dodaj szkiełka nakrywkowe.
nuta: Podłoże montażowe Elvanol składa się w 15% z żywicy polialkoholu winylowego i w 30% z gliceryny w PBS. Mieszaninę podgrzewa się, aż cała żywica się rozpuści, a gliceryna zostanie jednorodnie wymieszana. Można go zastąpić innym dostępnym na rynku medium montażowym.
- Pozostaw wierzchowiec do wyschnięcia na noc przed kwantyfikacją.
5. Kwantyfikacja fagocytozy
- Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym i soczewki obiektywowej 40X ręcznie określ ilościowo ilość zdarzeń fagocytarnych, licząc co najmniej 200 monocytów i liczbę fagocytozowanych R2R2 w tych monocytach. Trzymaj po jednym liczniku w każdej ręce, aby jednocześnie określić ilościowo liczbę monocytów i liczbę fagocytozowanychR2,R2.
- Uzyskaj średni indeks fagocytarny, dzieląc liczbę fagocytozowanychR2,R2 przez liczbę monocytów i mnożąc przez 100. Wyrazić dane jako średnią (średni indeks fagocytarny) ± błąd standardowy średniej (SEM).
