Pomiar alloreaktywności w mieszanej populacji limfocytów T

Streszczenie

Źródło: Juvet, S. C. et al., Pomiar alloreaktywności limfocytów T za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje metodę oceny alloreaktywności w mieszanych populacjach limfocytów T poprzez obserwację interakcji z komórkami dendrytycznymi przenoszącymi alloantygen, prowadzących do powstania synaps immunologicznych. Barwienie różnicowe i kwantyfikacja dubletów zawierających synapsy za pomocą cytometrii przepływowej ujawnia alloreaktywność limfocytów T.

Protokół

1. Przygotuj wymagane odczynniki i materiały

1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 2% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) ("bufor do przemywania "). Przygotować PBS z 2% płodową surowicą cielęcą (FCS) zawierającą 0,1% niejonowego detergentu ("bufor do trwałej ondulacji"; patrz tabela materiałów). Przygotuj PBS z 1,5% formaldehydem.
   nuta: Formaldehyd jest i potencjalnie rakotwórczy i należy się z nim obchodzić, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.
2. Przygotować PBS zawierający 2% FBS i 0,5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do magnetycznej separacji komórek ("buf....

Wyniki

Rysunek 1. Strategia bramkowania stosowana do identyfikacji alloreaktywnych synaps immunologicznych. A. Zdarzenia z ostrością są warunkowane od wszystkich zdarzeń poprzez przeglądanie obrazów komórek na podstawie średniej kwadratowej szybkości zmian profilu intensywności obrazu (Gradient RMS) przy użyciu kanału jasnego pola (kanał 4, kanał 04), zgodnie z opisem w tekście. B. Wśród z.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	rozmaity	Różni się
Kwas etylenodiamendotetraoctowy, roztwór 0,5 M	Thermo Fisher Naukowy	AM9260G
Niejonowy detergent Triton X-100	Sigma-Aldrich	Silnik X100
Beta-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M3148
Dimetylosulfotlenek	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418
Formaldehyd	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F1635	Roztwór składa się w 37% z formaldehydu, dlatego należy go rozcieńczyć 25 razy, aby uzyskać 1,5% roztwór
Sitka komórkowe, wielkość porów 70 μm	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 08-771-2
Izotiocyjanian falloidyny-fluoresceiny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5282
7-aminoaktynomycyna D	Thermo Fisher Naukowy	Ciągnik siodłowy A1310	Odtworzenie w DMSO
Anty-mysi sprzężony z allofikocyjaniną CD90.2	eBionauka	Numer katalogowy: 17-0902
Pacyficzny niebieski sprzężony anty-mysz CD11b	eBionauka	Numer telefonu 48-0112	Pacific blue został zastąpiony przez eFluor 450
Biotynylowany anty-mysz CD3	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0032
Biotynylowany przeciw myszom MHC klasy II	eBionauka	Numer katalogowy: 13-5321
Biotynylowany anty-mysz B220	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0452
Biotynylowany anty-mysz CD8	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0081
Biotynylowany anty-mysz CD19	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0193
Mikrogranulki antybiotynowe	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-090-485
Kolumny LS	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-401
Magnetyczny separator komórek MidiMACS	MIltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-302
Mysz rekombinowana GM-CSF	Peprotech	315-03
Rekombinowany ludzki TGFβ1	Peprotech	100-21	Ludzki TGFβ1 ma aktywność na komórkach myszy
Amnis ImageStream X Mark II	Amnis/EMD Millipore	N/a	Obrazowy cytometr przepływowy; szczegółowe informacje dostępne na stronie http://www.emdmillipore.com/
Oprogramowanie IDEAS	Amnis/EMD Millipore	N/a	Bezpłatne pobieranie (wymagana rejestracja): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Pożywka do hodowli komórkowych	rozmaity	Różni się
Surowica bydlęca płodu	rozmaity	Różni się
Płytki do hodowli komórkowych	rozmaity	Różni się

powiedział: TGL