Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Van Hoecke, L. et al., Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe mysich płuc w celu analizy infiltracji komórek zapalnych.J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie

1. Płyn do płukania
   1. Przygotować zbilansowany roztwór soli ze 100 μM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
      nuta: Aby zmierzyć poziom białka w płynie do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), zaleca się dodanie inhibitorów proteazy, aby zapobiec aktywności proteazy w płynie BAL.
2. cewnik
   1. Wykonaj cewnik, wkładając igłę 23 G do przezroczystej plastikowej rurk....

Wyniki

Rysunek 1: Strategia bramkowania do cytometrycznego wykrywania makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów T, limfocytów B, neutrofili i eozynofili w płynie BAL. Komórki BAL wyizolowano przy użyciu opisanego protokołu BAL. Komórki wyizolowano od myszy 24 godziny po wstrzyknięciu dotchawiczym lipopolisacharydu. Zliczanie koralików i komórek zostało zidentyfikowane na podstawie właściwości rozprosz.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zrównoważony roztwór soli	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. 14175-129
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	E6511	Irytujące
Igła 23G x 1 1/4	Henke Sass Wilk	4710006030	Rozmiar: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Wilk	4710004512	Rozmiar: 0,45*12 mm
Rurki z tworzywa sztucznego	Technologia medyczna BD	427411	Rurka polietylenowa, ID 0,58 mm (.023") OD . 965 mm (0,38") 30,5 m (100 stóp)
Pentobarbital sodu	Kela NV	Okręg wyborczy 514
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Lonza	BE17-516F	PBS bez Ca++ Mg++ lub czerwieni fenolowej; sterylny, filtrowany
Strzykawki 1ml	Henke Sass Wilk	5010.200V0	Niepirogenny i nietoksyczny
Kleszcze	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools GmbH	Numer katalogowy: 91460-11
Probówka wirówkowa 50 ml	Th. Geyer (Gejer)	7696705	Nie zawiera Rnazy/Dnazy/endotoksyny
Probówka wirówkowa 15 ml	Th. Geyer (Gejer)	7696702	Nie zawiera Rnazy/Dnazy/endotoksyny
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	polipropylen
Mikrowirówka	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał 5415R
wirówka	Thermo Fisher Naukowy	75004030
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)	Lonza	10-548E	Sterylne z filtrem
Żywy/martwy -efluor506	eBionauka	Nr kat. 65-0866-18	Możliwy do naprawienia barwnik żywotności
CD11c-PE-CY7	eNauki biologiczne	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Legenda biologiczna	107628
CD3-PE-CY5	Firma VWR	55-0031-U100
CD19-PE-CY5	eNauki biologiczne	Numer katalogowy: 15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Legenda biologiczna	127621
Koraliki do liczenia bezwzględnego	Life Technologies Europe B.V.	Zobacz materiał C36950
anty-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
96-dołkowa płyta do przechowywania 340 μl	sokół	353263	V-bottom, naturalny polipropylen
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne
cewnik	BD Nauki biologiczne	393202

powiedział: TGL