Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Streszczenie

Źródło: Van Hoecke, L. et al., Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe mysich płuc w celu analizy infiltracji komórek zapalnych.J. Vis. Exp.(2017)

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie

1. Płyn do płukania
   1. Przygotować zbilansowany roztwór soli ze 100 μM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
      nuta: Aby zmierzyć poziom białka w płynie do płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL), zaleca się dodanie inhibitorów proteazy, aby zapobiec aktywności proteazy w płynie BAL.
2. cewnik
   1. Wykonaj cewnik, wkładając igłę 23 G do przezroczystej plastikowej rurki z polietylenu 21 G (średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm i długość: 0,5 cm). Można również stosować gotowe cewniki.
3. Znieczulające
   1. Przygotować środek znieczulający terminalnie, najlepiej taki, który powoduje zatrzymanie oddechu (np. roztwór barbituranu, takiego jak pentobarbital sodu (>100 mg/kg) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS)).
      nuta: Zaleca się stosowanie znieczulenia iniekcyjnego zamiast znieczulenia wziewnego, ponieważ znieczulenie wziewne może wpływać na zawartość płynu BAL. Na przykład CO₂ ma wpływ na pH krwi, a w konsekwencji na redystrybucję różnych związków.
4. Bufor do lizy czerwonych krwinek chlorku amonu i potasu (ACK)
   1. Przygotować bufor do lizy ACK, rozpuszczając 8,29 g chlorku amonu (NH₄Cl) i 1 g wodorowęglanu potasu (KHCO₃) w 1 l_H2Oze 100 μM EDTA; bufor do lizy czerwonych krwinek można również zakupić z zewnętrznego źródła.

2. Przeprowadzanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)

1. Wprowadzenie cewnika do tchawicy
   1. Poddaj mysz eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie śmiertelnej dawki krótko działającego środka znieczulającego barbituranowego za pomocą igły 26 G. Aby potwierdzić prawidłowe znieczulenie śmiertelne, uszczypnij tylną łapę myszy kleszczami, aby sprawdzić odruch stopy.
   2. Połóż zwierzę na plecach na płytce chirurgicznej i przymocuj mysz, przygwożdżając kończyny.
   3. Spryskaj szyję 70% etanolem w celu dezynfekcji. Wykonaj nacięcie w skórze szyi w pobliżu tchawicy za pomocą skalpela.
   4. Otwórz skórę, aby odsłonić gruczoły ślinowe. Oddziel gruczoły ślinowe za pomocą szczypiec, aby odsłonić mięsień mostkowo-gnykowy. Naciąć mięsień wokół tchawicy za pomocą szczypiec, aby odsłonić tchawicę.
   5. Umieść bawełnianą nić pod tchawicą za pomocą szczypiec.
   6. Ostrożnie nakłuć środek odsłoniętej tchawicy między dwoma pierścieniami chrząstki za pomocą igły 26 G. Uważaj, aby nie uszkodzić tchawicy.
   7. Wprowadzić cewnik na około 0,5 cm do tchawicy. Upewnij się, że cewnik nie jest włożony zbyt głęboko w tchawicę, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia struktury płuc.
   8. Ustabilizuj cewnik, wiążąc tchawicę wokół cewnika za pomocą bawełnianej nici umieszczonej w kroku 2.1.5. Jeśli cewnik nie jest wystarczająco zawiązany, wstrzyknięty zrównoważony roztwór soli może płynąć w kierunku górnej części dróg oddechowych zamiast w dół do płuc.
2. Zbierz płyn do płukania
   1. Załadować strzykawkę o pojemności 1 ml 1 ml sterylnie zbilansowanego roztworu soli ze 100 μM EDTA.
   2. Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do cewnika i delikatnie wstrzyknąć roztwór soli/EDTA do płuca.
   3. Delikatnie zassaj roztwór, masując klatkę piersiową myszy. Jeśli odessany płyn nie jest widoczny w strzykawce, ostrożnie włóż cewnik nieco dalej lub w górę tchawicy.
   4. Wyjąć strzykawkę z igły i przenieść odzyskany płyn z płukania do probówki o pojemności 15 ml umieszczonej na lodzie. Zwykle 700 - 900 μl BAL odzyskuje się z 1 ml wstrzykniętego roztworu.
   5. Powtórz kroki 2.2.1 - 2.2.4 jeszcze dwa razy.
      nuta: Jeśli celem jest analiza zawartości niekomórkowej, zaleca się zagęszczenie próbek zbiorczych, gdy występują problemy z czułością.

3. Zbieranie komórkowych i niekomórkowych składników płynu BAL

1. Odwirowywać płyn popłuczyn przez 7 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C.
2. Zebrać supernatant i natychmiast użyć go do dalszej analizy (np. testu immunoenzymatycznego ELISA) lub zamrozić w temperaturze -80 °C. Przechowywać osad komórkowy w celu analizy napływu komórek do płuc
.
3. Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu lizującego ACK.
   nuta: Ten krok zapewnia lizę erytrocytów przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonych białych krwinek.
4. Inkubować przez 2 minuty w temperaturze suchej tonacji.
   nuta: Aby zmniejszyć zmienność spowodowaną lizą krwinek czerwonych, ten krok nie powinien być wykonywany dłużej niż 2 minuty.
5. Dodać 1 ml zimnego PBS, aby rozcieńczyć bufor lizujący ACK.
6. Wirować przez 7 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości PBS do dalszej analizy (patrz poniżej).
   nuta: Objętość PBS zależy od dalszego badania, które zostanie przeprowadzone.

4. Analiza różnych typów komórek w płynie BAL za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Jedną z możliwości jest analiza bezwzględnego i względnego składu komórkowego płynu BAL poprzez wykonanie cytometrii przepływowej. Celem niniejszej pracy jest opracowanie techniki BAL. Cytometria przepływowa sama w sobie jest techniką specjalistyczną. Zaleca się zapoznanie się ze specjalistycznymi pracami na temat techniki cytometrii przepływowej. Stosuje się przeciwciała sprzężone z fluoroforem, które rozpoznają antygeny powierzchniowe (patrz Tabela 1) specyficzne dla określonego typu komórek (komórek). Dzięki zastosowaniu strategii bramkowania możliwa jest identyfikacja limfocytów T, makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów B, eozynofili i neutrofili we frakcji komórkowej BAL.

1. Barwienie powierzchni komórek
   nuta: Ważne jest, aby uwzględnić wszystkie krytyczne elementy sterujące analizą cytometrii przepływowej. Potrzebne są trzy zestawy probówek (patrz tabela 2): (1) probówki zawierające próbki; (2) probówki z komórkami BAL dla każdego przeciwciała-fluoroforu w celu wytworzenia pojedynczych barwień; Pozwala to na określenie napięć dla każdego kanału na cytometrze przepływowym; oraz (3) probówki z kulkami dla każdego przeciwciała-fluoroforu do tworzenia pojedynczych barwień; Ma to na celu wyznaczenie macierzy wynagrodzeń.
   1. Sporządzić mieszaninę przeciwciał i bloku Fc (anty-CD16/CD32) w PBS w odpowiednich rozcieńczeniach (patrz Tabela 2). Konieczne jest określenie optymalnego rozcieńczenia roboczego dla każdego przeciwciała przed eksperymentem.
   2. Zawiesić komórki w 50 μl mieszaniny przeciwciał dla próbki i dodać 50 μl odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała do krytycznych kontroli.
      nuta: Barwienie można wykonać w 96-dołkowej płytce w kształcie litery U. Dzięki temu możliwe jest łatwe zmniejszenie objętości plamy i przeprowadzenie znacznych ilości próbek.
   3. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
   4. Wirować przez 7 minut w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
   5. Ponownie zawiesić komórki w PBS do końcowej objętości 200 μL.
      nuta: Ta końcowa objętość zależy od minimalnej objętości, do której może uzyskać dostęp cytometr przepływowy. Może się to nieznacznie różnić w zależności od maszyny. Ponadto objętość odczytu zależy od liczby komórek i/lub czasu, jaki próbka będzie potrzebna do przepuszczenia w cytometrze przepływowym.
   6. Do analizy metodą cytometrii przepływowej należy używać próbek i elementów sterujących.
      nuta: Aby określić bezwzględną liczbę komórek w różnych populacjach komórek, należy dodać koraliki do liczenia. Dodaj taką samą liczbę kulek (± 25 000 kulek) do każdej próbki tuż przed pomiarem. Korzystając z rozproszenia do przodu i boku, kulki zliczające można zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej (patrz rysunek 1). Następnie bezwzględną liczbę komórek w próbce można obliczyć, porównując stosunek zdarzeń koralików do zdarzeń komórek. Można użyć następującego wzoru:
      
2. Analiza metodą cytometrii przepływowej
   nuta: Analizę cytometrii przepływowej należy wykonać natychmiast po zakończeniu protokołu barwienia. Należy użyć cytometru przepływowego z odpowiednimi laserami i filtrami do wykrywania sygnału. Tabela 3 zawiera przegląd laserów i filtrów potrzebnych do badania opisanego w tym manuskrypcie. Aby uzyskać więcej informacji na temat analizy cytometrii przepływowej, zobacz Adan i wsp.
   1. Ustaw główne bramki w oparciu o rozrzut przedni i boczny, z wyłączeniem gruzu i dubletów (patrz rysunek 1).
   2. Dostosuj napięcie i kompensację nakładania się widma za pomocą pojedynczo barwionych komórek i kulek.
      nuta: Ustawienia te są różne dla każdego cytometru przepływowego i należy je sprawdzić przed każdym eksperymentem. Dla prawidłowej analizy przepływu krytyczne znaczenie mają napięcia rozproszenia czołowego i bocznego. Prawidłowe rozproszenie do przodu i z boku może pomóc w identyfikacji i potwierdzeniu tożsamości analizowanych komórek. Aby określić te napięcia, należy najpierw uruchomić niebarwioną próbkę.
   3. Ustawić bramki fluorescencyjne dla antygenu powierzchniowego (patrz rysunek 1) i przeanalizować próbki.

Tabela 1: Wybór antygenów powierzchniowych komórek odpornościowych. Ta tabela zawiera listę epitopów powierzchniowych używanych do charakteryzowania różnych typów komórek. Kombinacje kilku markerów będą wymagane do wiarygodnego zdefiniowania określonego typu komórki.

antygen	Typ komórki
Klaster różnicowania 3 (CD3)	Wyrażony na limfocytach T
Klaster różnicowania 11c (CD11c)	Wysoka ekspresja na większości komórek dendrytycznych, ale także na monocytach, makrofagach, neutrofilach i niektórych komórkach B.
Klaster różnicowania 11b (CD11b)	Ulega ekspresji na powierzchni wielu leukocytów, w tym monocytów, neutrofili, komórek NK, granulocytów i makrofagów.
SiglecF powiedział:	Makrofagi pęcherzykowe i eozynofile.
MHCII (Język MHCII)	Zwykle występuje tylko w komórkach prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, fagocyty jednojądrzaste i limfocyty B.
Płyta CD19	Antygen limfocytów B
Ly-6G	Marker monocytów, granulocytów i neutrofili

Tabela 2. Lista kontrolek, które mają zostać dołączone. Poniższa tabela przedstawia wszystkie niezbędne kontrole do dokładnej interpretacji uzyskanych wyników.

pkt. szt. Rozdział pkt. szt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział ) pkt. Rozdział Rozdział pkt. szt. Rozdział pkt. szt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział pkt. Rozdział ) pkt. Rozdział szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. pkt. szt. szt. ) pkt. szt.

Próbki
rura	Antygen-fluorofor dodawany do komórek	Stężenie przeciwciał (mg/ml)	Rozcieńczenie przeciwciał	Całkowita objętość (μL)
	Możliwy do naprawienia barwnik żywotności	0,2	1/1000	50
	Płyta CD11c	0,2	1/800	50
	SiglecF powiedział:	0,2	1/100	50
próbka X	MHCII (Język MHCII)	0,2	1/200	50
	Płyta CD3	0,2	1/200	50
	Płyta CD19	0,2	1/200	50
	Płyta CD11b	0,2	1/200	50
	Ly6G (Ły6G	0,2	1/200	50
Regulatory napięcia
rura	Antygen-fluorofor dodawany do komórek	Stężenie przeciwciał (mg/ml)	Rozcieńczenie przeciwciał	Całkowita objętość (μL)
Niebarwione komórki	/	/	/	50
Komórki barwione pojedynczo	Możliwy do naprawienia barwnik żywotności	0,2	1/1000	50
Komórki barwione pojedynczo	Płyta CD11c	0,2	1/800	50
Komórki barwione pojedynczo	SiglecF powiedział:	0,2	1/100	50
Komórki barwione pojedynczo	MHCII (Język MHCII)	0,2	1/200	50
Komórki barwione pojedynczo	Płyta CD3	0,2	1/200	50
Komórki barwione pojedynczo	Płyta CD19	0,2	1/200	50
Komórki barwione pojedynczo	Płyta CD11b	0,2	1/200	50
Komórki barwione pojedynczo	Ly6G (Ły6G	0,2	1/200	50
Mechanizmy kontroli kompensacji
rura	Antygen-fluorofor do dodania do koralików	Stężenie przeciwciał (mg/ml)	Rozcieńczenie przeciwciał	Całkowita objętość (μL)
Niepoplamione koraliki	/	/	/	200
Koraliki barwione pojedynczo	Płyta CD11c	0,2	1/2000	200
Koraliki barwione pojedynczo	SiglecF powiedział:	0,2	1/2000	200
Koraliki barwione pojedynczo	MHCII (Język MHCII)	0,2	1/200	200
Koraliki barwione pojedynczo	Płyta CD3	0,2	1/2000	200
Koraliki barwione pojedynczo	Płyta CD19	0,2	1/2000	200
Koraliki barwione pojedynczo	Płyta CD11b	0,2	1/400	200
Koraliki barwione pojedynczo	Ly6G (Ły6G	0,2	1/200	200

Tabela 3: Przegląd laserów i filtrów cytometru przepływowego użytego w tym badaniu.

Zobacz materiał

Typ lasera	Konfiguracja filtra
	505 LP	525/50
Niebieski (488 nm)	550 LP	nr 575/26
100 mW	670 LP	nr kat. 685/35
	750 LP	780/60
fioletowy 405 nm		Nr kat. 450/50
100 mW
czerwony 633 nm		nr kat. 660/20
70 mW	750 LP	780/60

Wyniki

Rysunek 1: Strategia bramkowania do cytometrycznego wykrywania makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów T, limfocytów B, neutrofili i eozynofili w płynie BAL. Komórki BAL wyizolowano przy użyciu opisanego protokołu BAL. Komórki wyizolowano od myszy 24 godziny po wstrzyknięciu dotchawiczym lipopolisacharydu. Zliczanie koralików i komórek zostało zidentyfikowane na podstawie właściwości rozprosz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zrównoważony roztwór soli	Thermo Fisher Naukowy	Nr kat. 14175-129
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Sigma-Aldrich	E6511	Irytujące
Igła 23G x 1 1/4	Henke Sass Wilk	4710006030	Rozmiar: 0,60 x 30 mm
26G x 1/2 neelde	Henke Sass Wilk	4710004512	Rozmiar: 0,45*12 mm
Rurki z tworzywa sztucznego	Technologia medyczna BD	427411	Rurka polietylenowa, ID 0,58 mm (.023") OD . 965 mm (0,38") 30,5 m (100 stóp)
Pentobarbital sodu	Kela NV	Okręg wyborczy 514
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Lonza	BE17-516F	PBS bez Ca++ Mg++ lub czerwieni fenolowej; sterylny, filtrowany
Strzykawki 1ml	Henke Sass Wilk	5010.200V0	Niepirogenny i nietoksyczny
Kleszcze	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Nożyczki chirurgiczne	Fine Science Tools GmbH	Numer katalogowy: 91460-11
Probówka wirówkowa 50 ml	Th. Geyer (Gejer)	7696705	Nie zawiera Rnazy/Dnazy/endotoksyny
Probówka wirówkowa 15 ml	Th. Geyer (Gejer)	7696702	Nie zawiera Rnazy/Dnazy/endotoksyny
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml	Sigma-Aldrich	0030 120.094	polipropylen
Mikrowirówka	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał 5415R
wirówka	Thermo Fisher Naukowy	75004030
Bufor lizujący chlorek amonu i potasu (ACK)	Lonza	10-548E	Sterylne z filtrem
Żywy/martwy -efluor506	eBionauka	Nr kat. 65-0866-18	Możliwy do naprawienia barwnik żywotności
CD11c-PE-CY7	eNauki biologiczne	25-0114-81
SiglecF-PE	BD Pharmingen	552126
MHCII-APCefluor780	Legenda biologiczna	107628
CD3-PE-CY5	Firma VWR	55-0031-U100
CD19-PE-CY5	eNauki biologiczne	Numer katalogowy: 15-0193-83
CD11b-V450	BD Pharmingen	560455
Ly6G-AF700	Legenda biologiczna	127621
Koraliki do liczenia bezwzględnego	Life Technologies Europe B.V.	Zobacz materiał C36950
anty-CD16/CD32	BD Pharmingen	553142
96-dołkowa płyta do przechowywania 340 μl	sokół	353263	V-bottom, naturalny polipropylen
Cytometr przepływowy	BD Nauki biologiczne
cewnik	BD Nauki biologiczne	393202

powiedział: TGL