1. Konfiguracja testów replikujących i niereplikujących MIC90
- Zaszczepić M. tuberculosis, M. bovis BCG lub M. smegmatis przy OD580 0,01-0,1 i rozwinąć do środkowej fazy logarytmicznej (OD580 ~ 0,5) w Middlebrook 7H9-ADN (Middlebrook 7H9 zawierający 0,2% glicerolu, 0,2% dekstrozy, 0,5% albuminy i 0,085% NaCl) lub 7H9-OADC (Middlebrook 7H9 zawierający 0,2% glicerolu i 10% suplementu OADC).
- Hodować M. tuberculosis i M. bovis BCG jako ~20 ml stojących kultur w kolbach do hodowli komórkowych, a M. smegmatis z wytrząsaniem w okrągłodennych polipropylenowych probówkach okrągłodennych (4 ml hodowli) lub stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml (10-20 ml hodowli). Inkubować chorobotwórcze prątki w temperaturze 37 °C z 20%O2 i 5% CO2 oraz M. smegmatis w temperaturze 37 °C z 20%O2 .
- Przeprowadzić eksperyment w stylu minimalnego stężenia hamującego (MIC90) w warunkach replikacji i niereplikacji (ryc. 1).
nuta: Czynniki testowe są zwykle oznaczane w duplikatach lub poczwórnych duplikatach, aby umożliwić testowanie odpowiednio 4 lub 2 związków na 96-dołkową mikropłytkę. Na przykład na płytce 96-dołkowej jeden czynnik testowy można oznaczyć w wierszach A-D, a drugi w wierszach E-H. DMSO (nośnik) znajduje się w kolumnach 1, 2 i 12, a seria rozcieńczeń badanego czynnika biegnie od kolumny 3 (najniższe stężenie) do kolumny 11 (najwyższe stężenie). Testy typu MIC90 zazwyczaj wykorzystują 2-krotną serię rozcieńczeń. Dostępnych jest wiele modeli niereplikujących się dla prątków, a w celach ilustracyjnych używamy modelu wielostresowego braku replikacji.
- Do testu replikacji rozprowadź 200 μl komórek w 7H9-ADN przy OD580 0,01 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z przezroczystym dnem, poddanej kulturze tkankowej.
- W przypadku testu niereplikującego należy dwukrotnie umyć komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) zawierającej 0,02% tyloksapolu i ponownie zawiesić komórki w pożywce niereplikującej (0,05% KH2PO4, 0,05%MgSO4, 0,005% cytrynian żelazowo-amonowy, 0,0001% ZnCl2, 0,1% NH4Cl, 0,5% BSA, 0,085% NaCl, 0,02% tyloksapol, 0,05% maślan; pH dostosowane do 5,0 z 2 N NaOH).
- Rozcieńczyć komórki do OD580 0,1 w pożywce niereplikującej i dodać NaNO2 ze świeżo przygotowanego 1 M materiału do końcowego stężenia 0,5 mM.
- Rozprowadzić 200 μl komórek o średnicy zewnętrznej580 0,1 do wszystkich studzienek 96-dołkowej płytki z czystym dnem, poddanej kulturze tkankowej.
nuta: Przygotować rozcieńczenia złożone jako 100-krotne roztwory podstawowe w DMSO. Tak więc typowa płytka MIC badająca wpływ cząsteczki przy końcowym stężeniu 0,4-100 μg/ml wymagałaby roztworów podstawowych 0,04-10 mg/ml w DMSO.
- Dodać 2 μl rozcieńczeń badanego czynnika 1 do rzędów A-E i 2 μl rozcieńczeń badanego czynnika 2 do rzędów E-H. Dokładnie wymieszaj.
- Dodać 2 μl kontroli nośnika (zwykle DMSO) do studzienek kontrolnych, kolumny 1, 2, 12 (rzędy A-H). Dokładnie wymieszaj.
- Dla każdego doświadczenia należy uwzględnić co najmniej jedną kontrolę dodatnią, taką jak ryfampicyna, w dawce od 0,004 do 1 μg/ml (test replikujący) i/lub 0,08 do 20 μg/ml (test niereplikujący).
nuta: Zaleca się stosowanie 6-bromo-1H-indazol-3-aminy9 w stężeniu od 0,1 do 25 μg/ml jako związku kontrolnego, który ma selektywną, zależną od NaNO2 aktywność w wielostresowym modelu niereplikacji.
- W przypadku testów replikacyjnych inkubować mikropłytki w temperaturze 37 °C przy 20%O2 i 5% CO2 przez 7 dni (M. tuberculosis i M. bovis BCG) lub 1-48 godzin (M. smegmatis). W przypadku wielostresowego modelu niereplikacji inkubować mikropłytki przez 7 dni w temperaturze 37 °C przy 1%O2 i 5% CO2 (M. tuberculosis i M. bovis BCG).
2. Inokulacja mikropłytek CARA
- W punktach czasowych, w których CARA będzie używana jako odczyt, należy ostrożnie ponownie zawiesić zawartość studzienki na płytce testowej typu MIC90 za pomocą pipety wielokanałowej p200 ustawionej na 50-75 μl. Pipetować w górę i w dół co najmniej 5-10 razy i delikatnie obracać zawartość studzienki okrężnymi ruchami za pomocą końcówek do pipet.
- Przenieść 10 μl zawartości basenika testowego na mikropłytkę CARA. Upewnij się, że kolejność zawartości studzienki na płytce testowej jest zgodna z kolejnością zawartości studzienki na mikropłytce CARA. Unikaj rozpryskiwania się podczas przenoszenia i upewnij się, że 10 μl zostało dostrzeżone w środku studzienek na mikropłytki CARA. Upewnij się, że 10 μl wchłania się do mikropłytki CARA.
nuta: Nie ma potrzeby rozcieńczania przed nakrapianiem komórek na mikropłytkach CARA.
- Zwiąż stosy mikropłytek CARA taśmą klejącą, a następnie umieść je w zamykanej plastikowej torbie. Inkubować mikropłytki CARA w temperaturze 37 °C z 20%O2 (M. smegmatis) lub 1%O2 i 5% CO2 (M. tuberculosis i M. bovis BCG).
- Dla M. tuberculosis i M. bovis BCG, testy replikujące: inkubować przez 7 dni; dla M. tuberculosis i M. bovis BCG testować bez replikacji, inkubować przez 10 dni; dla M. smegmatis, próby replikujące, inkubować przez 1-2 dni; dla M. smegmatis, testy niereplikujące, inkubować 2-3 dni.
UWAGA: Czasy są szacunkowe i mogą być odpowiednio modyfikowane dla różnych warunków replikacji, niereplikacji i naprężeń.
3. Opracowywanie mikropłytek CARA
- Mikropłytki CARA należy rozwijać, gdy na ujemnych (nośnikowych) studzienkach kontrolnych widoczny jest film wzrostu bakterii lub większe, makroskopowe kolonie.
nuta: Po długotrwałej inkubacji studzienki mikropłytkowe CARA często wydają się suche i zalecamy wstępne zwilżenie zawartości studzienki sterylnym PBS. Ma to na celu zapobieżenie wchłanianiu resazuryny przez węgiel drzewny, co może prowadzić do niskiej fluorescencji lub zmienności między studniami.
- Używając pojedynczego zestawu 12 końcówek p200 z pipetą wielokanałową, dozuj 40 μl sterylnego PBS wzdłuż boku studzienek i pozwól PBS rozprowadzić się po górnej części mikrokolonii agarowych/bakteryjnych.
- Przygotować odczynnik wywołujący CARA, mieszając 5 mg rezazuryny (0,01% końcowej) i 50 ml 5% Tween-80 w PBS. Filtr wirowy i sterylny.
nuta: Alternatywny odczynnik do wywoływania CARA można przygotować, mieszając komercyjnie przygotowany płynny roztwór rezazuryny w stosunku 1:1 (obj./obj.) z 10% Tween80 w PBS.
- Dodać 50 μl świeżo przygotowanego odczynnika wywołującego CARA do każdego dołka mikropłytki CARA za pomocą 12-kanałowej pipety. Kołysz płytki kilka razy w przód iw tył, aby pomóc rozprowadzić odczynniki po agarze i macie bakteryjnej w każdej studzience.
- Umieścić płytki w zamykanej plastikowej torbie i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 30 minut w przypadku M. smegmatis i 45–60 minut w przypadku M. tuberculosis lub M. bovis BCG.
nuta: Jeśli studzienki kontrolne pojazdu nie zmienią koloru na różowy w ciągu pierwszej godziny, płytki można ponownie zapakować i inkubować przez dłuższy czas.
- Przed odczytem fluorescencji należy umieścić mikropłytki CARA w okapie bezpieczeństwa biologicznego na 15 minut w temperaturze pokojowej ze zdjętymi pokrywkami. W przypadku korzystania ze spektrofotometrów BSL3 poza szafą bezpieczeństwa biologicznego, przyklej naklejkę PCR o jakości optycznej na płytce i szczelnie zamknij, delikatnie dociskając powierzchnię naklejki miękkim ręcznikiem papierowym.
- Określić fluorescencję za pomocą odczytu od góry ze wzbudzeniem przy 530 nm i emisją przy 590 nm. Nie ma potrzeby zaślepiania płyty.
