1. Przygotowanie pożywek i odczynników
- Przygotuj pożywkę fibroblastyczną. Połącz 450 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml penicyliny/streptomycyny. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
- Przygotować reporterowe pożywki do wzrostu makrofagów w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml FBS, 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (tabela materiałów) i 200 μg/ml fleomycyny D1 (tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
- Przygotować pożywkę do oznaczania makrofagów reporterowych w 50 ml podwielokrotności. Połącz 45 ml DMEM, 5 ml inaktywowanego termicznie FBS (HI-FBS), 5 μg/ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy i 200 μg/ml fleomycyny D1. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
2. Powlekanie powierzchni kultur komórkowych poli(metakrylanem metylu)
- Rozpuścić poli(metakrylan metylu) (PMMA) w chloroformie w stężeniu 20 mg/ml (np. 100 mg PMMA w 5 ml chloroformu) w szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml. Umieścić mieszadło magnetyczne w fiolce i pozostawić do mieszania przez co najmniej 2 godziny, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą.
ostrożność: Chloroform jest szkodliwy w przypadku wdychania. Upewnij się, że używasz rozpuszczalnika w dygestorium podczas noszenia rękawic PVA.
- Odpipetować 400 μl roztworu PMMA na środek szkiełka mikroskopowego ze szkła borokrzemianowego w powlekarce wirowej i wirować z prędkością 3000 obr./min przez 2 minuty. Przygotować liczbę szkiełek podstawowych wymaganą do testu, a także 3−5 dodatkowych do pomiaru kąta zwilżania wody. Przechowuj szkiełka w czystym pudełku (spryskanym i przetartym 70% etanolem) do wykorzystania w przyszłości.
nuta: Powłoka wirowa jest często używana do osadzania cienkiej, jednolitej powłoki na płaskiej powierzchni. Powlekarka wirowa obraca podłoże z dużą prędkością, wykorzystując siłę odśrodkową do rozprowadzenia roztworu powlekającego po powierzchni.
- Zmierz kąt zwilżania wody w dwóch losowych miejscach na powierzchni dodatkowych powlekanych szkiełek (tj. nie szkiełek używanych do hodowli komórkowych) za pomocą goniometru, aby upewnić się, że powierzchnia szkła jest całkowicie pokryta polimerem.
UWAGA: Do pomiarów kąta zwilżania wody należy używać wyłącznie wody o najwyższej czystości (np. szklanej potrójnie destylowanej).
- W komorze bezpieczeństwa biologicznego (BSC) przymocuj 8-komorowe lepkie studzienki do szkiełek pokrytych PMMA za pomocą sterylnych kleszczyków i zgodnie z techniką aseptyczną. Mocno dociśnij górną część lepkich studzienek, aby upewnić się, że są mocno przymocowane. Inkubować szkiełka z dołączonymi lepkimi studzienkami w temperaturze 37 °C przez noc w celu zabezpieczenia uszczelki.
- Przetestuj szczelność lepkich studzienek, dodając do każdej studzienki 200 μl wody klasy hodowli komórkowej (wolnej od endotoksyn). Inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 60 minut i upewnić się, że nie ma wycieków przed kontynuowaniem. Zassać wodę, uważając, aby nie naruszyć powłoki PMMA.
- Wykonaj płukanie wodą bez endotoksyn, dodając 300 μl wody wolnej od endotoksyn do każdej studzienki i inkubując przez 1 godzinę (trzy razy), 12 godzin i 24 godziny przed użyciem w celu usunięcia pozostałego rozpuszczalnika.
- Zbadać stężenie endotoksyn w szkiełkach, które mają być użyte do hodowli komórek. Inkubować 200 μl wody z odczynnikiem wolnym od endotoksyn (tabela materiałów) w jednym dołku każdego szkiełka przez 1 godzinę. Zmierzyć stężenie endotoksyny w ekstrakcie za pomocą końcowego testu endotoksyn chromogennych (tabela materiałów).
nuta: Poniższy protokół jest specyficzny dla zestawu do oznaczania endotoksyn wymienionego w tabeli materiałów.
- Do tej pracy należy używać wyłącznie wody i materiałów eksploatacyjnych (tj. końcówek pipet, probówek do mikrowirówek i płytek studzienkowych), które są certyfikowane jako wolne od pirogenów (tj. wolne od endotoksyn). Ponadto, wszelkie wyroby szklane użyte do przygotowania powierzchni pokrytych polimerem powinny być przed użyciem poddane depirogenizacji za pomocą sterylizacji na sucho (250 °C przez 30 minut). Pomiar endotoksyny w roztworze ekstraktu, jak opisano tutaj, może spowodować niedoszacowanie endotoksyny na powierzchni materiału. W związku z tym zaleca się, aby podczas opracowywania protokołu powlekania polimerowego przeprowadzić reakcję oznaczania endotoksyn (tj. kroki 2.6.4−2.6.6 dla próbek testowych [woda odczynnika] lub kontrole kolców) bezpośrednio w studzienkach zawierających pokrytą próbkę, aby upewnić się, że żadne źródła endotoksyny nie zostaną przypadkowo wprowadzone do systemu podczas procesu powlekania.
- Przynieś wszystkie badane próbki (tj. ekstrakty) i odczynniki do oznaczania endotoksyn do RT. Rozpuść odczynnik chromogenny w buforze testowym i wzorcu endotoksyny w wodzie z odczynnikiem, pozostaw do rozpuszczenia na 5 minut i delikatnie zawiruj przed użyciem. Przykryj wszystkie butelki folią parafinową, gdy nie są używane.
- Utwórz 5-8-punktową standardową krzywą rozcieńczenia wzorca endotoksyny, począwszy od dolnej do górnej granicy testu, wykonując seryjne rozcieńczanie wzorca endotoksyny w wodzie z odczynnikiem.
- W celu kontroli wzmocnienia lub zahamowania testu endotoksyny w badanych próbkach, należy przygotować kontrolę pozytywną (zwaną również kontrolą kolca lub próbką wzbogaconą) poprzez rozcieńczenie znanej ilości endotoksyny w niewykorzystanym roztworze próbki testowej.
nuta: Stężenie kontroli dodatniej powinno być takie samo jak stężenie wzorca w środku krzywej wzorcowej. Jeżeli odzyskana ilość kolca endotoksyny (tj. stężenie kontroli dodatniej pomniejszone o stężenie próbki testowej bez wzbogacenia) mieści się w zakresie 50-200% nominalnego stężenia kolca endotoksyny, można uznać, że roztwór ekstrakcyjny nie zakłóca znacząco testu.
- Dodać 50 μl wzorców, próbek lub kontrolnych kolców do każdego dołka na 96-dołkowej płytce w dwóch lub trzech kroplach. Użyj wody odczynnika jako kontroli negatywnej.
- Dodaj 50 μl odczynnika chromogennego do każdego dołka. Szybko dodaj odczynnik do wszystkich studzienek. Użyj timera, aby zarejestrować czas potrzebny na dodanie odczynnika do wszystkich studzienek. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować w temperaturze 37 °C (czas inkubacji zależy od partii i jest podany w certyfikacie analizy dołączonym do zestawu odczynników chromogennych). Alternatywnie, sprawdzaj płytkę co 15 minut podczas inkubacji, aż do zaobserwowania zmiany koloru we wszystkich standardowych studzienkach.
- Po inkubacji dodać 25 μl 50% kwasu octowego do każdego dołka (końcowe stężenie 10% kwasu octowego na studzienkę), aby zatrzymać reakcję. Dodaj kwas octowy w tej samej kolejności, w jakiej dodano odczynnik chromogenny. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 405 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę.
nuta: Dodanie kwasu octowego powinno zająć tyle samo czasu, aby dodać do każdego dołka, ile zajęło odczynnik chromogenny (± 30 s).
- Ultrafioletem (UV) sterylizuj szkiełka przez 30 minut przed eksperymentami z hodowlą komórkową.
3. Wytwarzanie lizatu z komórek 3T3
- Hoduj komórki 3T3 w wielu kolbach T150 do 70% konfluencji. Aby odłączyć komórki, odessać pożywkę, umyć powierzchnię 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odessać PBS. Dodać 5 ml niepochodzącego od zwierząt, rekombinowanego enzymu dysocjacji komórek (tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-5 min.
- Odłączyć komórki, delikatnie przechylając kolbę do przodu i do tyłu. Dodaj 5 ml PBS, aby zneutralizować rekombinowany enzym używany do dysocjacji komórek. Przenieść oderwane komórki z kolb do probówki wirówkowej i wymieszać przez pipetowanie. Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek.
nuta: Wybrano enzym dysocjacji komórek, który można zneutralizować poprzez rozcieńczenie w PBS, aby uniknąć wprowadzania białek na bazie surowicy do preparatu lizatu. Jeśli trypsyna jest używana do dysocjacji komórek, należy ją zneutralizować roztworem zawierającym surowicę i przeprowadzić dodatkowe płukanie PBS w celu zmniejszenia ilości białek surowicy przenoszonych do preparatu lizatu.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w pierwotnej objętości (tj. 10 ml x liczba kolb) PBS w celu zmycia pozostałej pożywki. Powtórzyć.
- Ponownie odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut i odessać supernatant. Dodać objętość PBS wymaganą do osiągnięcia końcowego stężenia komórek 1 x 106 komórek/ml. Umieścić roztwór komórkowy w zamrażarce o temperaturze -80 °C do momentu całkowitego zamrożenia próbki (co najmniej 2 godziny).
- Rozmrozić roztwór komórek w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po całkowitym rozmrożeniu umieść roztwór z powrotem w zamrażarce o temperaturze -80 °C, aż do całkowitego zamrożenia. Powtórz w sumie 3 cykle zamrażania i rozmrażania.
- Wykonać test kwasu mikrobicinchoninowego (BCA) na lizacie komórkowym w różnych rozcieńczeniach (np. 1/100, 1/200, 1/500, 1/1000) w celu określenia stężenia białka. Rozcieńczyć lizat komórkowy do stężenia białka 468,75 μg/ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
nuta: Końcowe stężenie białka w 48-dołkowej płytce wynosi 125 μg/cm2 (w przeliczeniu na powierzchnię jednego dołka, 0,75cm2).
- Wykonaj Western blot, aby ocenić obecność DAMP w lizacie (np. białko szoku cieplnego 60 [HSP60], grupa o wysokiej mobilności pole 1 [HMGB1]), ładując 40-60 μg białka lizatu w buforze ładującym na 10% żel poliakrylamidowy o grubości 1,5 mm i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami Western blot.
4. Ocena wpływu zaadsorbowanych warstw białkowych i receptorów toll-podobnych na aktywność NF-κB makrofagów
UWAGA: Aby zapoznać się ze schematem eksperymentalnego przepływu pracy i układu płyt, patrz odpowiednio Rysunek 1A i Rysunek 2.
- Hoduj makrofagi reporterowe w kolbie o odpowiedniej wielkości do 70% konfluencji. Zassać pożywkę, umyć powierzchnię PBS i odessać PBS. Dodać rekombinowany enzym dysocjacji komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 8 minut.
- Odłączyć komórki, mocno stukając w boki kolby. Dezaktywować rekombinowany enzym dysocjacji komórek, dodając równą objętość pożywki wzrostowej (zawierającej 10% FBS). Wykonaj zliczanie żywych komórek za pomocą hemocytometru i barwnika żywotności komórek.
nuta: Oczekiwana żywotność makrofagów reporterowych po 8-minutowej inkubacji w enzymie dysocjacji komórek wynosi 90%.
- Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w pierwotnej objętości PBS w celu przepłukania komórek. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić komórki w stężeniu 7,3 x 105 komórek/ml w pożywce testowej (zawierającej inaktywowany termicznie FBS).
- Oddziel zawiesinę komórkową do 3 różnych probówek: inhibitora TLR4, anty-TLR2 i nieleczonej. Inkubować komórki z 1 μg/ml inhibitorem TLR4 przez 60 minut w RT lub z 50 μg/ml anty-TLR2 przez 30 minut w RT.
- Dodać 200 μl lizatu, 10% FBS, 10% komercyjnego osocza myszy (tabela materiałów) lub mieszaninę roztworów białkowych do 48-dołkowej płytki (lub równoważnej) i pozostawić białko do adsorpcji w temperaturze 37 °C przez żądany czas (tj. 30 min, 60 min lub 24 h). Odessać roztwory białkowe ze studzienek, używając świeżej pipety Pasteura do każdego roztworu białkowego, i przemyć powierzchnie 250 μl PBS przez 5 minut. Powtórz w sumie 3 prania.
nuta: Ten krok może wymagać wcześniejszego rozpoczęcia w protokole, w zależności od pożądanego czasu adsorpcji. Dostosuj odpowiednio protokół.
- Po okresie inkubacji z inhibitorem TLR4 lub anty-TLR2 należy ponownie zawiesić komórki pipetowane. Dodaj 200 μl roztworu komórkowego do każdej studzienki.
- W przypadku warunku kontroli pozytywnej TLR2 dodać Pam3CSK4 (Pam3Cys-Ser-(Lys)4) do końcowego stężenia 150 ng/ml. W przypadku warunków kontroli pozytywnej TLR4 dodać lipopolisacharyd (LPS) do końcowego stężenia 1,5 μg/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 20 godzin.
- Pobrać próbkę 20 μl supernatantu z każdej studzienki i płytki w dwóch egzemplarzach do płytki 96-dołkowej. Dołączyć trzy studzienki z 20 μl pożywki do oznaczania jako kontrolę tła. Dodać 200 μl odczynnika reporterowego SEAP do każdego dołka. Przykryć płytkę uszczelką adhezyjną i inkubować przez 2,5 godziny w temperaturze 37 °C.
nuta: Czas inkubacji może się różnić w zależności od warunków doświadczalnych i powinien być zoptymalizowany pod kątem dużej różnicy w absorbancji między studzienkami kontroli dodatniej i ujemnej.
- Przenieść pozostałą część supernatantu do probówki o pojemności 1,5 ml (na studzienkę). Wirować przy 1,000 x g przez 10 minut, aby osadzać wszelkie zanieczyszczenia. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C. Analizować supernatant pod kątem obecności cytokin prozapalnych (np. czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α), interleukiny 6) za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).
- Usuń uszczelkę płytki samoprzylepnej. Odczytać absorbancję płytki za pomocą czytnika płytek przy długości fali 635 nm. Odessać płyn i wyrzucić płytkę.
