1. Generacja lentiwirusa kodującego CAR
UWAGA: Po zakończeniu budowy plazmidu limfocytów T specyficznego receptora antygenu chimerycznego (CAR) (CD47 i inne), lentiwirusowe CAR są generowane standardową procedurą, przy użyciu 293 komórek FT, mieszanki opakowań lentiwirusowych i środków transfekcyjnych (patrz Tabela Materiałów) zgodnie z opisem. Następnie należy użyć ilościowego zestawu do reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) i termocyklera (patrz tabela materiałów), aby określić miano wirusa poprzez pomiar ilości lentiwirusowego RNA zgodnie z protokołem producenta. Ważne jest, aby wszystkie zabiegi lentiwirusowe były przeprowadzane ściśle zgodnie z wymogami bezpieczeństwa.
- Wysiewaj 15 x 106 HEK293FT komórek w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco i inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 °C w jednym naczyniu o średnicy 150 mm w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla (CO2 ).
- Przygotuj dwie probówki o pojemności 15 ml z kompleksem transfekcji. Pierwsza probówka zawiera plazmidowe DNA wektora lentiwirusowego (5 μg) i mieszaninę opakowaniową lentiwirusa (22,5 μg) w 2,5 ml roztworu do rozcieńczania transfekcji. Druga probówka zawiera 82,5 μl odczynnika do transfekcji w 2,5 ml roztworu do rozcieńczania transfekcji (patrz tabela materiałów).
- Odpipetować zawartość probówki 1 do probówki 2 i inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Przenieść zawartość probówki kroplami do naczynia z HEK293FT komórkami i inkubować próbkę przez noc w temperaturze 37 °C w zwilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla2 .
- Następnego dnia zastąpić istniejącą pożywkę 19 ml świeżej pożywki hodowlanej DMEM i kontynuować inkubację komórek przez noc w nawilżonym inkubatorze 5%CO2 w temperaturze 37 °C.
- Przenieś pożywkę z naczynia do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Probówkę z pożywką zawierającą wirusa należy przechowywać w lodówce.
- Powtórz powyższą procedurę, dodając świeży DMEM i zbierając go ponownie po 1 dniu.
- Połącz dwie kolekcje pożywek w jedną probówkę wirówkową. Odwirować probówkę o stężeniu 2 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
- Przenieść większość supernatantu zawierającego lentiwirusa do ultraprzezroczystej probówki wirówkowej. Pozostawić minimalną objętość, około 1 ml supernatantu, aby uniknąć naruszenia osadu, który może zawierać komórki i/lub zanieczyszczenia.
- Ultraodwirować wyżej oczyszczony supernatant w temperaturze 110 000 x g przez 100 minut w temperaturze 4 °C.
- Ostrożnie usunąć supernatant i delikatnie dodać 100 μl pożywki DMEM do osadu wirusa na dnie probówki. Pozostaw probówkę na lodzie na 15 minut. Delikatnie wymieszać roztwór i podzielić roztwór lentiwirusa na porcje do wstępnie schłodzonych sterylnych probówek. Probówki z wirusem należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
- Użyj ilościowego zestawu RT-PCR, aby określić miano lentiwirusa zgodnie z protokołem producenta, który ekstrahuje i mierzy lentiwirusowe RNA.
2. Generowanie i rozbudowa komórek CAR T
- Aktywować uprzednio zamrożone ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) (około 1 x 106 do 2 x 106 komórek) w 1 ml pożywki z limfocytów T CAR z równą liczbą mikrogranulek pokrytych CD3/CD28 (patrz tabela materiałów) i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 24 godziny.
- Rozmrozić podwielokrotność zapasu lentiwirusa na lodzie.
- Dodaj 1 μl środka zwiększającego transdukcję do studzienki z komórkami i wymieszaj.
- Dodaj lentiwirusa do komórek przy wielokrotności infekcji (MOI) 5:1 i delikatnie wymieszaj. Następnego dnia powtórz ten krok (24 godziny po pierwszej transdukcji).
- Monitoruj wzrost limfocytów T co 2-3 dni. Dodaj więcej świeżej pożywki z komórek T CAR, aby utrzymać komórki w gęstości 1 x 106 do 2 x 106 komórek/ml.
- Zamrażać limfocyty CAR T za pomocą standardowego protokołu przy użyciu roztworu do zamrażania (patrz Tabela materiałów).
- Rozmrozić limfocyty CAR T przy użyciu standardowej metody i wstępnie wyhodować je w pożywce CAR T-cell przez około ~ 2-4 godziny z interleukiną-2, IL-2 (300 jednostek / ml) przed zastosowaniem ich do testu.
3. Wykrywanie ekspresji CAR za pomocą cytometrii przepływowej
- Przenieś 3 x 10 5 limfocytów T CAR i nietransdukowane limfocyty T do dwóch oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.
- Odwirować probówki o masie 300 x g przez 2 minuty i ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) zawierającego 1% surowicy ludzkiej.
- Odpipetować 100 μl roztworu komórkowego do dwóch probówek FACS z polistyrenu o pojemności 5 ml i trzymać probówki na lodzie przez 5 minut.
- Dodaj 1 μl biotynylowanego koziego anty-mysiego F(ab')2 do jednej probówki każdego typu komórek. Następnie dodaj 2 μl fikoerytryny, przeciwciała antyznacznikowego znakowanego PE (patrz tabela materiałów) do drugiej probówki każdego typu komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj je na lodzie przez 30 minut.
- Przemyć komórki 3 ml buforu FACS w każdej probówce i odwirować probówki o stężeniu 300 x g przez 5 minut; odrzucić supernatanty i bardzo krótko przemieszać lub krótko wstrząsnąć probówkami w celu ponownego zawieszenia komórek w pozostałej cieczy.
- Dodać 2 μl anty-CD3 komórek prezentujących antygen (APC) i 2 μl roztworu przeciwciała 7-aminoaktynomycyny D (7-AAD) (patrz tabela materiałów) do każdej probówki. Do probówki z komórkami wybarwionymi anty-F(ab')2 Ab dodać 1 μl streptawidyny znakowanej PE. Krótko wymieszaj i inkubuj probówki na lodzie jeszcze przez 30 minut.
- Użyj buforu FACS, aby ponownie umyć komórki, jak opisano w kroku 3.5 i dodaj dodatkowe 200 μl buforu FACS do każdej probówki.
- Użyj cytometrii przepływowej do analizy komórek, najpierw bramkując na komórkach T na wykresie rozproszenia do przodu w stosunku do wykresu punktowego bocznego, a następnie bramkując na żywych komórkach (7-AAD-ujemnych) na wykresie CD3 w porównaniu z 7-AAD. Ostatnim krokiem jest analiza anty-tag, anty-ScFv lub anty-F(ab')2 w porównaniu z CD3.
4. Test siły cytolizy w czasie rzeczywistym (RTCA)
UWAGA: Wykonaj test RTCA zgodnie z warunkami zalecanymi przez producenta. Krótko mówiąc, najpierw umieść komórki docelowe w dołkach E-Plate, a następnie dodaj komórki CAR T następnego dnia. Aktywność cytolizy limfocytów CAR T w stosunku do komórek docelowych jest monitorowana w czasie rzeczywistym. Limfocyty T i imitowane limfocyty T (pozorowane limfocyty T CAR) są używane jako negatywne kontrole komórek efektorowych. Poniższy protokół opisuje test siły działania cytolizy in vitro w czasie rzeczywistym dla przylegających linii komórek nowotworowych.
- Dodać 100 μl pożywki do hodowli komórek docelowych do każdego dołka płytki xCELLigence E-Plate, umieścić płytkę wewnątrz urządzenia xCELLigence i wykonać odczyt tła. Następnie przenieś E-Plate do kaptura do hodowli tkankowej w celu wysiewu komórek.
- Użyj standardowego protokołu do trypsynizacji docelowych komórek rakowych z urządzenia do hodowli. Następnie przenieś komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i dodaj świeżą pożywkę hodowlaną do 15 ml. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant, dodać 5 ml świeżej pożywki i użyć pipety serologicznej, aby delikatnie zawiesić osad komórkowy. Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i mikroskopu.
- Odpowiednio dostosuj gęstość komórek, a następnie dodaj 100 l zawiesiny komórek do każdego dołka E-Plate. Docelowa liczba komórek wynosi zwykle około 10 000 komórek / studzienkę dla przylegających linii komórkowych (BxPC3, Hela-CD19 i SKOV3) lub 30 000 komórek / studnię dla komórek zawiesinowych, takich jak Raji (poniżej znajdują się szczegółowe informacje dotyczące wstępnego powlekania studzienek przeciwciałami w celu związania płynnych komórek rakowych).
- Równoważ E-Plate w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby komórki równomiernie osiadły na dnie studzienki (jest to krytyczne; nie pomijaj tego kroku).
- Umieść E-Plate w przyrządzie xCELLigence wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych i rozpocznij pomiar impedancji, wyświetlanej jako wskaźnik komórki w funkcji czasu, automatycznie co 15 minut.
- Następnego dnia przygotuj efektorowe limfocyty CAR T. Upewnij się, że przygotowałeś odpowiednie kontrole (tj. pozorowane limfocyty CAR T, nietransdukowane kontrolne limfocyty T i/lub niepowiązane limfocyty CAR T) z wyprzedzeniem, aby upewnić się, że wszystkie komórki są gotowe w tym samym czasie. Dostosuj komórki efektorowe i komórki kontrolne do odpowiedniej gęstości i przygotuj seryjne rozcieńczenia, aby zapewnić osiągnięcie pożądanych proporcji E:T po dodaniu 100 μl zawiesiny komórek efektorowych do każdej studzienki w kroku 9.
- Wstrzymaj gromadzenie danych xCELLigence i przenieś płytkę E-Plate z inkubatora do okapu do hodowli komórkowych.
- Usunąć 100 μl pożywki z każdej studzienki. Ilość pozostałego podłoża w każdym dołku wynosi teraz 100 μL.
- Dodać 100 μl seryjnie rozcieńczonych efektorowych komórek CAR T lub innych komórek kontrolnych (tj. makiet komórek CAR T), aby osiągnąć pożądane proporcje E:T.
- Równoważ E-Plate w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby umożliwić ogniwom efektorowym osiadanie, a następnie umieść E-Plate z powrotem w przyrządzie xCELLigence. Wznawianie pobierania danych.
- W razie potrzeby w kluczowych momentach czasowych akwizycja danych xCELLigence może zostać wstrzymana, a płytka usunięta w celu pobrania małych próbek do analizy za pomocą testów ortogonalnych (tj. pomiaru produkcji cytokin za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub cytometrii przepływowej).
- W eksperymencie z limfocytami T CAR EGFR-GITR-CD3 zmierz wydajność interferonu gamma (IFNγ) za pomocą zestawu ELISA (postępuj zgodnie z instrukcjami producenta; patrz Tabela materiałów).
nuta ODNOŚNIE STOSOWANIA NOWOTWORÓW PŁYNNYCH: W celu badania nieprzylegających hematologicznych komórek nowotworowych, przed dodaniem komórek, studzienki E-Plate są najpierw powlekane przeciwciałem, które jest specyficzne dla antygenu, który ulega ekspresji na powierzchni komórek rakowych. W przypadku linii komórek Raji B stosuje się odczynnik do wiązania na bazie anty-CD40 (patrz zestaw do oznaczania zabijania płynnych nowotworów w Tabeli materiałów). Poniżej znajduje się procedura powlekania płyty:
- Rozcieńczyć odczynnik do wiązania (anty-CD40) buforem do wiązania do stężenia 4 μg/ml.
- Pracując w kapturze do hodowli tkankowych, dodaj 50 μl rozcieńczonego odczynnika do wiązania do każdego dołka E-Plate. Pozostaw E-Plate w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 3 godziny.
- Usuń odczynnik do wiązania i umyj E-Plate co najmniej 2x buforem do mycia. W tym momencie E-Plate jest gotowy do wysiewu komórek docelowych Raji (30 000 komórek/studzienkę).
- Kontynuuj krok 4.1 (powyżej), aby wykonać pozostałą część procedury.
