1. Przygotowanie mediów i rozwiązań
- Przygotować pożywkę hodowlaną: RPMI-1640 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), pH 7,4.
- Przygotować pożywkę do oznaczania: RPMI-1640 bez czerwieni fenolowej, ale z 1% FBS, pH 7,4.
- Przygotować roztwór do przemywania komórek: roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco wolny od Mg i Ca z 0,02% EDTA, pH 7,4.
- Przygotuj roztwór do odrywania komórek: 0,125% trypsyny z 1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
- Rozmrozić 100 ml 0,25% roztworu trypsyny-EDTA i przenieść do sterylnej kolby o pojemności 500 ml.
- Wymieszać ze 100 ml roztworu do przemywania komórek i dozować 15 ml porcji do sterylnych probówek o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze od -70 do -80 °C do momentu użycia.
- Przefiltruj te roztwory przez membranę 0,22 μm i podgrzej do 37 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem.
- Przygotować roztwór podstawowy TNFα indukujący apoptozę o stężeniu 3,3 μg/ml.
- Rozpuścić 20 μg TNFα w 500 μl wysterylizowanej przez filtr wody w pojemniku pierwotnym i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Przenieść do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i dodać do niej 5,5 ml roztworu DPBS wolnego od Mg i Ca. Delikatnie wymieszaj za pomocą miksera wirowego.
- Roztwór podzielić na porcje o objętości 70 μl. Dozować każdą porcję do mikroprobówek o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
- Przygotować roztwór indukcji apoptozy: TNFα roztwór o stężeniu 40 ng/ml.
- Rozmrozić podwielokrotność roztworu podstawowego do indukcji apoptozy, inkubując go w łaźni wodnej w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
- Rozcieńczyć roztwór podstawowy indukcji apoptozy do 40 ng/ml przez dodanie 61 μl 3,3 μg/ml roztworu TNFα do 4,939 ml pożywki do oznaczania w sterylnej probówce o pojemności 15 ml.
- Mieszać mikserem wirowym przez 10 sekund; roztwór ten należy przygotować świeżo przed użyciem.
- Ogrzewać roztwór do temperatury 37 °C przez co najmniej 30 minut przed użyciem w teście neutralizacji.
- Przygotować roztwór substratu: roztwór kaspazy 3/7 Glo.
- Rozmrozić roztwór buforu kaspazy (bufor kaspazy 3/7 Glo) przez 12 godzin przed użyciem.
- Pozostawić roztwór buforowy kaspazy i substrat (substrat kaspazy 3/7 Glo) oddzielnie w temperaturze 25 ± 5 °C na 30 minut przed zmieszaniem.
- Przenieść 10 ml roztworu buforu kaspazy do fiolki z substratem i wymieszać przez odwrócenie.
- Przechowywać w temperaturze 25 ± 5 °C, chronić przed światłem do czasu użycia.
nuta: Roztwór jest stabilny przez 6 godzin w temperaturze pokojowej.
2. Hodowla i liczenie komórek
- Rozmrażanie komórek i pierwsza subkultura.
- Wyjąć jedną fiolkę z komórkami WEHI 164 z zamrażarki w temperaturze -80 °C i przenieść ją do łaźni lodowej.
- Pipetować w górę i w dół 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aż zamrożone komórki całkowicie się rozmrozą.
- Dozować 9 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do sterylnej probówki o pojemności 15 ml.
- Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wymieszać pięć razy przez odwrócenie.
- Odwirować zawiesinę komórkową o masie 125 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i rozdzielić osad komórkowy.
- Dodać 5 ml pożywki hodowlanej do probówki. Mieszaj, aż komórki zostaną całkowicie ponownie zawieszone.
- W celu zliczenia komórek przenieś 50 μl zawiesiny komórek do mikroprobówki o pojemności 500 μl i wymieszaj z 50 μl 0,4% błękitu trypanowego. Policz komórki i dostosuj je do 0,5 x 106 komórek/ml. Zobacz krok 2.2 poniżej.
- Dodać 13 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do kolby o pojemności 75 ml.
- Dozować wystarczającą objętość zawiesiny komórek z kroku 2.1.6, aby uzyskać 0,5 x 106 komórek/ml w kolbie do hodowli komórkowej i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
- Zliczanie komórek.
- Korzystając z roztworu z kroku 2.1.6, przenieś 0,05 ml do hemocytometru i oznacz gęstość komórek pod mikroskopem za pomocą wykluczenia błękitu trypanowego.
- Określ ilościowo całkowitą liczbę komórek i komórek żywotnych.
- Dostosuj zawiesiny komórek do 0,5 x 106 komórek/ml.
Vpożywka hodowlana(ml) = 
Vpożywka hodowlana (ml) = (5 ml -zawiesina komórek V)
Vpożywka hodowlana (ml) = Skorygowana objętość zawiesiny komórek WEHI 164
NVC = liczba żywotnych komórek WEHI 164/ml
Vpożywka hodowlana (ml) = objętość pożywki do hodowli testowej dodana do zawiesiny komórkowej w celu uzyskania 0,5 x 106 komórek/ml
0,5 x 106 = Docelowa gęstość komórek
- Oderwanie komórek oraz druga i trzecia subkultura.
nuta: Do usuwania roztworów z kolb można użyć systemu próżniowego. Można używać pipet jednorazowych lub sterylnych szklanych. Jeśli pipeta ma bawełniany chodak u góry, należy go usunąć przed użyciem.
- Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolby T do hodowli komórkowych za pomocą sterylnej pipety o pojemności 1 ml i podciśnienia.
- Dozować 5 ml roztworu do płukania komórek do kolby T do hodowli, delikatnie wymieszać i wyrzucić roztwór. Powtórz ten krok dwukrotnie.
nuta: Całkowite usunięcie pożywki hodowlanej ma kluczowe znaczenie dla skutecznego odłączania komórek.
- Dodać 15 ml roztworu do oddzielania komórek do kolby T i odstawić na 3 minuty w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Sprawdzić pod mikroskopem, czy w wewnętrznej ściance kolby nie ma przyłączonych komórek. Usunąć komórki z T-kolby hodowlanej za pomocą sterylnej pipety o pojemności 20 ml i dozować je do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
- Odwirować zawiesinę komórkową o sile 125 x g przez 3 minuty. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad z kolejnymi 5 ml pożywki hodowlanej.
- Policz komórki i dodaj tyle pożywki hodowlanej, aby osiągnąć pożądane stężenie komórek zgodnie z równaniem 1.
- Dodać tę zawiesinę do kolby T o średnicy 72cm2 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Subkulturuj komórki co najmniej dwa razy przed użyciem ich w teście neutralizacji. Powtarzaj kroki 2.3.1-2.3.8 przez następne dwa dni.
- Zawiesina komórek testowych.
- Wybierz subkulturę WEHI 164, która ma co najmniej trzy przepustki. Patrz krok 2.1.
- Odłącz i policz komórki zgodnie z krokami 2.2 i 2.3 tego protokołu.
- Rozcieńczyć zawiesinę komórek zgodnie z równaniem 1 do 0,5 x 106 komórek/ml.
- Użyj tej zawiesiny komórkowej do testu neutralizacji. Przed użyciem wymieszać wszystkie zawiesiny komórkowe z mieszalnikiem wirowym.
3. Przygotowanie przeciwciał i rozcieńczenia
- Oznaczanie ilościowe mAb.
- Oznaczyć stężenie substancji odniesienia, próbki kontrolnej i próbki analitycznej poprzez absorpcję UV przy długości fali 280 nm, stosując ich współczynnik ekstynkcji masowej (1,39).
nuta: Pierwotne stężenia można pobrać z etykiet produktów leczniczych. Musi to być jednak zweryfikowane przez absorpcję promieniowania UV.
- Rozcieńczenia mAb.
- Rozcieńczyć wszystkie próbki niezależnie w trzech egzemplarzach roztworem wolnym od DPBS Mg i Ca w mikroprobówkach o objętości 2 ml do 2 mg/ml. Potwierdź to stężenie przez absorpcję UV w trzech powtórzeniach, używając roztworu wolnego od Mg i Ca DPBS jako ślepej próby.
- Mieszaj podstawowe roztwory białek przez 5 sekund za pomocą mieszalnika wirowego.
- Rozcieńczyć 100 μl każdego roztworu mAb o stężeniu 2 mg/ml 0,9 ml pożywki do oznaczania.
- Mieszaj przez 5 s za pomocą mieszalnika wirowego.
nuta: Roztwory te mają stężenie 200 μg/ml. Rozcieńczenia należy wykonać dla każdej potrójnej próby.
- Rozcieńczyć 10 μl każdego roztworu mAb o stężeniu 200 μg/ml w 0,99 ml pożywki do oznaczania. Mieszaj przez 5 s za pomocą miksera wirowego. Roztwory te mają stężenie 2 μg/ml. Wykonać seryjne rozcieńczenia dla każdego potrójnego roztworu przed użyciem ich w teście neutralizacji.
- Wykonaj rozcieńczenia anty-TNFα mAb na trzech niezależnych mikropłytkach. Wykonać duplikat z każdej niezależnej potrójnej dawki i dozować je do jednej mikropłytki, jak wskazano w Tabeli 1. Substancja odniesienia
- Przeprowadzić rozcieńczenia mAb każdego wzorca, próbki lub kontroli, jak pokazano w tabeli 2.
nuta: Stężenia przeciwciał anty-TNFα opisane w tej tabeli nie są stężeniami końcowymi w teście neutralizacji.
- Przechowywać płytki w temperaturze 25 ± 5 °C do czasu użycia.
4. Test neutralizacji za pomocą komórek WEHI 164
- Wymieszać przez wirowanie wszystkich zawiesin komórkowych (0,5 x 106 komórek/ml) przed dozowaniem na dowolnym etapie tego protokołu.
nuta: W tej części należy ogrzać każdy roztwór do temperatury 37 °C przez 30 minut przed użyciem.
- Przenieść 50 μl zawiesiny komórek do każdej z 60 studzienek mikropłytek, przesuwając się z kolumny 2 do 11 i z linii B do G.
- Przenieść 50 μl mAb roztworów referencyjnych, próbek i rozcieńczeń kontrolnych do mikropłytek. Postępuj zgodnie ze wzorem przedstawionym na rysunku 1.
- Dodać 50 μl roztworu indukcji apoptozy do każdej studzienki.
- Użyj kontroli komórkowej 50 μl komórek WEHI 164, dozowanych w trzech dołkach. Doprowadzić każdą studzienkę do końcowej objętości 150 μl za pomocą pożywki do oznaczania.
- Stosować kontrolę cytotoksyczności mieszaniny 50 μl komórek WEHI 164 plus 50 μl roztworu indukcji apoptozy. Doprowadzić każdą studzienkę do końcowej objętości 150 μl za pomocą pożywki do oznaczania.
- Do kontroli TNFα należy użyć 50 μl roztworu indukcji apoptozy i doprowadzić do 150 μl za pomocą pożywki do oznaczania.
- Do ślepej próby należy użyć 150 μl samej pożywki do oznaczania.
- Pozostałe studzienki napełnić 150 μl pożywki hodowlanej, aby uniknąć efektu parowania płytek.
- Powtórzyć kroki 4.1.1-4.1.9 dwukrotnie na dwóch innych mikropłytkach.
nuta: Końcowe stężenia mAb w mikropłytce wynoszą: 0,666, 0,333, 0,167, 0,111, 0,083, 0,056, 0,042, 0,028, 0,014 i 0,004 μg/ml.
- Załadować próbki do mikropłytek, jak pokazano na rysunku 1
- Inkubować trzy płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 16 ± 2 godzin.
- Odczynnik kaspazy 3/7 Glo odstawić w temperaturze 25 ± 5 °C na 30 minut przed użyciem.
- Dodać 100 μl tego odczynnika do wszystkich studzienek, w tym do próbek i kontroli.
- Wstrząsać płytkami za pomocą mieszalnika wirowego do mikropłytek przez 3 minuty w temperaturze 25 ± 5 °C natychmiast po dozowaniu do studzienek.
- Inkubować płytki przez 2,5 ± 0,5 godziny w temperaturze 25 ± 5 °C, chroniąc przed światłem.
- Włóż mikropłytki do luminometru i wykonaj następną sekcję.
5. Analiza wyników
- Korzystając z oprogramowania do wykrywania luminescencji, wybierz tryb luminescencji i funkcję punktu końcowego.
- Wybierz 96-dołkową płytę z przezroczystym dnem i jej 80 dołków wewnętrznych, z wyłączeniem kolumn 1 i 12.
- Wybierz czas integracji 1 250 ms i 10 s na mieszanie mikropłytki przed odczytem.
- Należy wybrać studzienki, w których zostanie umieszczona substancja odniesienia, substancja analityczna i próbka kontrolna, i zidentyfikować je za pomocą odpowiadających im stężeń.
- Odczytać próbki umieszczone w mikropłytkach za pomocą luminometru.
- Do analiz wyników należy użyć równania czwartego parametru. Proszę sporządzić wykres krzywej dawka-odpowiedź, jak pokazano na rysunku 2.
UWAGA: W czwartym równaniu parametru C jest stężeniem efektywnym 50 (EC50). Wartość ta zostanie wykorzystana do porównania substancji odniesienia, próbki analitycznej i próbki kontrolnej za pomocą funkcji efektora.
- W celu obliczenia względnych potencji należy ustalić substancję odniesienia na 100%, obliczyć moc próbki i odpowiednio kontrolować.
nuta: Wartości te przedstawiono na rysunku 3.
Tabela 1: Tablice próbek mikropłytek. Pełny test neutralizacji musi być przeprowadzony na trzech mikropłytkach we współrzędnych od B2 do G11. Wyrywkowe dozowanie próbek referencyjnych, analitycznych i kontrolnych pozwala badaczom zweryfikować wszelkie błędy systematyczne w teście.
| Tabliczka 1 | Tabliczka 2 | Tabliczka 3 |
| Wells | próbka | Wells | próbka | Wells | próbka |
| B2:B11 | Substancja referencyjna | B2:B11 | Próbka kontrolna | B2:B11 | Próbka analityczna |
| C2:C11 | C2:C11 | C2:C11 |
| D2:D11 | Próbka analityczna | D2:D11 | Substancja referencyjna | D2:D11 | Próbka kontrolna |
| E2:E11 | E2:E11 | E2:E11 |
| F2:F11 | Próbka kontrolna | F2:F11 | Próbka analityczna | F2:F11 | Substancja referencyjna |
| G2:G11 | G2:G11 | G2:G11 |
Tabela 2: Rozcieńczenia przeciwciał anty-TNFα. Seryjne rozcieńczenia przeciwciał anty-TNFα przedstawiono w tej tabeli. Końcowe stężenia opisane w tej tabeli nie są stężeniami w teście, w którym przeciwciała anty-TNFα rozcieńczono czynnikiem 3 (rozcieńczenie mAb + pożywka hodowlana + zawiesina komórek). Linie pogrubione reprezentują rozcieńczenia pochodzące z linii 3, 5, 7, 9 i 10; Niepogrubione linie reprezentują rozcieńczenie od linii 3, 4 i 6. Te seryjne rozcieńczenia wykonuje się tuż przed wykonaniem testu neutralizacji. Należy zachować ostrożność podczas mieszania, pipetując trzykrotnie w górę i w dół przed dozowaniem rozcieńczeń.
szt.
szt.
szt.
Rozdział
szt.
szt.
Rozdział
szt.
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
Rozdział
szt.
| Kolumna płytowa | Objętość pożywki do oznaczania (μl) | Objętość substancji odniesienia, próbki analitycznej lub próbki kontrolnej (uL) | Stężenie na płytce testowej (ng/ml) |
| cyfra arabska | 0 | 230 | Rok 2000 |
| 3 | 150 | 150 z linii 2 | 1000 |
| 4 | 75 | 75 z linii 3 | 500 |
| 5 | 100 | 50 z linii 3 | Rozdział 333 |
| 6 | 75 | 75 z linii 4 | Z kolei 250 |
| 7 | 75 | 75 z linii 5 | Rozdział 166 |
| 8 | 75 | 75 z linii 6 | 125 |
| 9 | 75 | 75 z linii 7 | Rozdział 83 |
| 10 | 75 | 75 z linii 9 | Rozdział 41 |
| 11 | 150 | 75 z linii 10 | 13 |
