1. Produkcja naiwnych MoDC
UWAGA: Próbki krwi pełnej pobrano od pojedynczego cielęcia wolnego od patogenów poprzez nakłucie żyły szyjnej za pomocą heparynizowanych próżniowych (do tego badania użyto ośmiu probówek z krwią o pojemności 9 ml). Krew należy transportować w pojemniku na lód. Próbki należy przechowywać w temperaturze 2–4 °C do późniejszego użycia lub natychmiast je przetworzyć. Utrzymuj krążenie krwi, aby uniknąć krzepnięcia krwi. Wysterylizuj wakutainery 70% etanolem. Wszystkie poniższe eksperymenty przeprowadzono na jednej próbce biologicznej i sześciu powtórzeniach technicznych.
- Wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania PBMC z krwi poddanej heparyniźnie
- Dobrze wymieszaj krew, odwracając ją 10x.
- Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś 20 ml krwi poddanej heparyniźnie do sterylnej probówki o pojemności 50 ml i rozcieńcz ją 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Odpipetować 15 ml pożywki do izolacji limfocytów do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Przed pipetowaniem należy odczekać, aż pożywka izolująca limfocyty osiągnie temperaturę pokojową.
- Przechylić probówkę o pojemności 50 ml zawierającą pożywkę do izolacji limfocytów do pozycji 45°. Skieruj końcówkę pipety o pojemności 25 ml prostopadle i ostrożnie ułóż 30 ml PBS krwi na pożywce do izolacji limfocytów, nie mieszając tych dwóch. Bardzo powoli ustawić probówkę o pojemności 50 ml z powrotem w pozycji pionowej.
- Wirować przy 800 × g przez 35 minut w temperaturze 20 °C z maksymalnym przyspieszeniem i bez hamowania (funkcja opóźniania jest wyłączona).
- Za pomocą pipety Pasteura zebrać warstwę PBMC (cienką białą warstwę zaraz po pierwszej warstwie osocza) i przenieść ją do nowej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Wirowanie w gradiencie gęstości rozdziela krew pełną na różne warstwy. W rezultacie erytrocyty osiadają na dole jako osad, komórki jednojądrzaste (PBMC) osiadają w warstwie interfejsowej, a plazma tworzy warstwę górną. Granulocyty znajdują się między osadem a warstwą PBMC.
- Zebrane PBMC umyć 2x, dodając PBS do objętości 40 ml i dokładnie mieszając, pipetując w górę iw dół. Następnie odwirować przy 500 × g w temperaturze 4 °C przez 7 minut z maksymalnym przyspieszeniem i opóźnieniem.
- Odrzucić supernatant przez dekantację, ponownie zawiesić osad w 15 ml 1x buforu chlorkowo-potasowego (ACK) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10-15 min.
nuta: Nie inkubować dłużej niż 15 minut. Dostępny w handlu bufor ACK służy do zapewnienia lizy resztkowych czerwonych krwinek (RBC) obecnych we frakcji PBMC.
- Dodać PBS do objętości 40 ml, a następnie odwirować w temperaturze 500 × g i 4 °C przez 7 minut z maksymalnym przyspieszaniem i zwalnianiem.
- Odrzucić supernatant przez dekantację i powtórzyć krok 1.1.9.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywki hodowlanej (w temperaturze pokojowej).
nuta: Kompletna pożywka hodowlana składa się z pożywki do hodowli komórkowych RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny.
- Separacja magnetyczna komórek CD14+/- od populacji PBMC za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z CD14
- Policz komórki za pomocą czystego licznika komórek hemocytometru, używając 10 μl zawiesiny komórek zmieszanej z 10 μl roztworu błękitu trypanowego (0,4%.
UWAGA: Barwnik błękitu trypanowego jest toksyczną substancją chemiczną i potencjalnym czynnikiem rakotwórczym. Należy obchodzić się z nim podczas noszenia środków ochrony osobistej (PPE), aby uniknąć kontaktu, a odpady należy wyrzucać do hermetycznego specjalistycznego pojemnika na odpady toksyczne. Martwe komórki będą niebieskie, podczas gdy żywe komórki będą czyste pod mikroskopem.
- Wirować przez 7 minut przy 500 × g.
- Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić osad w aktywowanym fluorescencją buforze do sortowania komórek (FACS), stosując objętość 40 μl na każde 1 ×10 7 komórek. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety.
UWAGA: Bufor FACS składa się z 2% FBS i 2 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) rozpuszczonego w PBS.
- Dodać 5 μl buforu mikrokulkowego CD14 na 1 × 107 komórek i dokładnie wymieszać za pomocą pipety.
- Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4-8 °C w celu uzyskania pozytywnej selekcji bydlęcych monocytów CD14+. Wirować co 15 minut w okresie inkubacji.
- Etap opcjonalny (do analizy metodą cytometrii przepływowej): Dodać 10 μl przeciwciała barwiącego CD14-FITC (izotiocyjanian fluoresceiny), a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 4-8 °C. Szczegółowe informacje można znaleźć w analizie cytometrii przepływowej w kroku 5.
- Dodać 1 ml buforu FACS i wirować przez 7 minut w temperaturze 500 × g.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu FACS na 1 × 108 komórek.
- Włóż immunomagnetyczną kolumnę do separacji komórek do separatora (uchwyt kolumny magnetycznej) i umieść probówkę o pojemności 15 ml pod wylotem kolumny w celu zebrania przepływu.
- Przemyć kolumnę 1 ml odgazowanego buforu FACS. Po wypłukaniu wymień zużytą probówkę o pojemności 15 ml na nową.
- Pozwolić, aby zawiesina komórek (z kroku 1.2.8) przeszła przez kolumnę, pipetując jednorazowo 1 × 108 komórek w 500 μl buforu.
nuta: Zwróć uwagę, aby nie generować pęcherzyków powietrza podczas mieszania komórek przed przepuszczeniem ich przez kolumnę.
- Za każdym razem przepłukać kolumnę 3 ml odgazowanego buforu FACS.
- Zbierz przepływ i oznacz tę pierwszą eluowaną frakcję jako frakcję komórkową CD14 (PBMC minus monocyty CD14 +); jest to również nazywane naiwną frakcją limfocytów.
nuta: Komórki CD14− są utrzymywane w kompletnej pożywce hodowlanej do momentu wytworzenia MoDC impulsowych antygenem.
- Wyjmij kolumnę z separatora.
- Umieść nową sterylną probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną do zbierania ścieków.
- Odpipetować 5 ml buforu FACS do kolumny i natychmiast przepchnąć go przez nią za pomocą tłoka.
- Zbierz przepływ i oznacz tę drugą eluowaną frakcję jako frakcję komórek CD14 +; nazywa się to również frakcją naiwnych monocytów.
- Dodać kompletną pożywkę hodowlaną do zebranych monocytów CD14 +, aby uzyskać 1 × 106 komórek/ml.
nuta: Policz żywe komórki w eluowanej frakcji komórek CD14 +, aby oszacować objętość kompletnej pożywki hodowlanej wymaganej do uzyskania pożądanej liczby komórek.
- Weź sterylną 24-dołkową płytkę i dodaj 1 ml zawiesiny komórkowej (1 × 106 komórek/ml) do każdej studzienki.
- Różnicowanie nieuszkodzonych monocytów CD14+ w naiwne MoDC przez dodanie 3% w/v koktajlu cytokin (GM-CSF + IL-4) w sumie 5 dni inkubacji
- Uzupełnij każdą studzienkę zawierającą monocyty CD14+ w 40 μl (3% w/v) koktajlu cytokin dołączonego do zestawu.
- Inkubować płytkę w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 i w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
- W dniu 2 przenieść połowę zawartości każdej studzienki (500 μl) za pomocą pipety do pojedynczych probówek o pojemności 1,5 ml i odwirować w temperaturze 500 × g w temperaturze 4 °C przez 7 minut.
- Odrzucić sklarat i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej.
- Przenieść 500 μl tej zawiesiny komórek z kroku 1.3.4 z powrotem do każdej wyznaczonej studzienki, tak aby końcowa objętość wynosiła 1 ml.
- Wzbogać każdą studzienkę o 20 μl koktajlu cytokinowego.
- Inkubować kulturę przez 72 godziny w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 i w temperaturze 37 °C.
- Po inkubacji w 5 dniu wyjąć płytkę z inkubatora.
UWAGA: Każda studzienka będzie zawierała 1 ml zawiesiny komórkowej naiwnych MoDC. Liczba MoDC będzie stanowić procent (~ 20%) oryginalnych monocytów posianych (1 × 106 / ml).
2. Generowanie MoDC z impulsami antygenowymi
UWAGA: Komercyjnie dostępna i klinicznie zatwierdzona szczepionka przeciwko wirusowi wścieklizny (RV) może wywołać różnicowanie się naiwnych MoDC w dojrzałe MoDC prezentujące antygen. Użyj 0,1% (~1 μL) pojedynczej dawki szczepionki RV do wygenerowania MoDC z impulsami antygenowymi. Ponadto preferowane jest wytwarzanie MoDC z impulsem RV na tej samej płytce hodowlanej, która jest używana do generowania naiwnych MoDC, ponieważ przeniesienie naiwnych MoDC na nową 24-dołkową płytkę wpłynie na nie negatywnie.
- Dodać 1 μl/ml zawiesiny RV do 1 ml naiwnej kultury MoDC na płytce 24-dołkowej i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
UWAGA: naiwne MoDC hodowane bez stymulacji RV są używane jako kontrola tła (i jako nieswoista stymulacja do kohodowli z limfocytami w kolejnych krokach).
- Po inkubacji, w dniu 7, przechowywać 24-dołkową płytkę zawierającą MoDC impulsowane antygenem na lodzie przez 10 minut.
- Dodaj 1 ml lodowatego PBS do dołka. Każdą studzienkę dokładnie wymieszać pipetując i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 15 ml.
- Umyj studzienki 2 ml lodowatego PBS, aby zebrać resztki komórek pozostawione w każdym dołku.
- Przenieść zawartość do odpowiednich probówek i odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 500 × g przez 7 minut.
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy (MoDC pulsujący antygenem) w kompletnym pożywce hodowlanej i dostosować objętość do końcowego stężenia komórek 1 × 105 komórek/ml.
nuta: Policz żywe komórki, aby oszacować objętość podłoża wymaganą do uzyskania pożądanej liczby komórek. Używaj MoDC z impulsem RV od 7 dnia do systemu kohodowli limfocytów MoDC.
3. Współhodowla limfocytów MoDC
UWAGA: System kohodowli limfocytów MoDC in vitro określa zdolność MoDC do inicjowania limfocytów specyficznych dla antygenu. Różne grupy leczone komórkami po 16 dniach wspólnej hodowli obejmują specyficzne, niespecyficzne i kontrolne. Specyficzną grupę definiuje się jako limfocyty współhodowane z MoDC pulsującymi RV; grupę nieswoistą definiuje się jako limfocyty współhodowane z MoDC niepulsującymi antygenem; a grupę kontrolną definiuje się jako limfocyty hodowane bez MoDC.
- Dodać kompletną pożywkę hodowlaną do eluowanej frakcji naiwnych limfocytów (komórki CD14−), aby uzyskać stężenie komórek 2 × 106 komórek/ml.
UWAGA: Policz żywe komórki w hodowli komórkowej CD14−, które były utrzymywane w kompletnej pożywce hodowlanej na 24-dołkowej płytce od czasu ich pobrania, aby oszacować objętość pożywki wymaganą do osiągnięcia pożądanej liczby komórek.
- W dniu 7 weź sterylną 24-dołkową płytkę i zasiej dołki 1 ml pierwotnej zawiesiny komórek limfocytów (2 × 106 komórek/ml) plus 1 ml zawiesiny MoDC impulsowej antygenem lub niepulsującej antygenem (1 × 105 komórek/ml).
nuta: Całkowita objętość w każdym dołku wyniesie 2 ml w stosunku 1:20 MoDC do limfocytów na studzienkę.
- Inkubować płytkę przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Wzbogacanie i restymulacja kultur za pomocą pulsujących antygenów MoDC
- Po inkubacji kohodowli limfocytów MoDC z impulsami antygenu, w dniu 9, uzupełnij każdą studzienkę rekombinowanym IL-2 o stężeniu 20 ng / ml i kontynuuj inkubację przez kolejne 120 godzin (5 dni inkubacji).
- W dniu 14 przenieś 1 ml kokultury do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 500 × g przez 7 minut.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 1 ml pulsacyjnych lub niepulsacyjnych MoDC (1 × 105 komórek/ml). Delikatnie wymieszać pipetując i przenieść zawiesiny komórek z powrotem do wyznaczonych dołków.
nuta: Na tym etapie całkowita objętość w każdym dołku wynosi 2 ml.
- Kontynuować inkubację w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Po inkubacji w 16 dniu kokultura jest gotowa do analizy przy użyciu cytometrii przepływowej, qPCR i ELISA.
nuta: Na każde 2 ml w każdym dołku kohodowli limfocytów MoDC, 1 ml ponownie zawieszonych komórek jest barwiony do cytometrii przepływowej, 1 ml jest używany do ekstrakcji RNA, a supernatanty z obu są używane do testu ELISA.
4. Analiza cytometryczna przepływowa
UWAGA: Zabarwić komórki odpowiednimi markerami/mAb przed uruchomieniem próbek na cytometrze przepływowym. Zapoznaj się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat odczynników (barwienie mAb i kontrole izotypu), zestawu, przyrządu i oprogramowania używanego do analizy cytometrii przepływowej.
- Protokół barwienia cytometrem przepływowym
nuta: Wykonaj barwienie powierzchni komórek dla PBMC oraz wcześniej nieuszkodzonych limfocytów i monocytów za pomocą mAb anty-CD14 (krok 1.2.6). Do barwienia powierzchni komórek naiwnych MoDC należy użyć mAb specyficznych dla anty-CD86, anty-CD40 i anty-MHC II. Do barwienia powierzchni komórek z kokultur w dniu 16 należy użyć mAb anty-CD4, anty-CD8 i anty-CD25; do barwienia wewnątrzkomórkowego użyj anty-Ki-67 mAb. Ponadto wybarwić komórki ujemnym kontrolnym izotypem mAb lub bez mAb (FMO: fluorescencyjna minus jeden). Główna różnica w barwieniu markerów powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych polega na tym, że w przypadku markerów powierzchniowych komórek komórki muszą być barwione specyficznym powierzchniowym mAb przed barwieniem żywym/martwym (L / D) lub jakimikolwiek innymi procesami. Jednak barwienie wewnątrzkomórkowe jest wykonywane po barwieniu L / D i wymaga etapu utrwalania i przepuszczalności, aby umożliwić penetrację wewnątrzkomórkową.
- Przenieść 1 ml zawiesiny komórkowej do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety i wirować przez 10 minut w temperaturze 500 × g.
UWAGA: Po odwirowaniu, podczas przetwarzania komórek z kokultury limfocytów MoDC, zachowaj supernatant do analizy ELISA.
- Zawiesić osad w 1 ml PBS i przenieść go do probówki o pojemności 15 ml. Zebrać pozostałe komórki za pomocą 1 ml PBS i połączyć je z zawieszonym osadem.
- Dodać 10 ml PBS do probówki o pojemności 15 ml zawierającej komórki, wymieszać pipetując i odwirować przez 7 minut przy 850 x g.
- Odrzucić supernatant i powtórzyć krok 4.1.3.
- Odrzucić supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy z pozostałą zawiesiną (około 180 μl) pozostałą po dekantacji supernatantu.
- Przenieś zawiesinę komórek na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V i uszczelnij studzienki, aby uniknąć rozlania.
- Odwirować płytkę o masie 1 400 × g przez 5 minut. Po odwirowaniu przesuń płytkę nad pojemnikiem na odpady, aby opróżnić studzienki z płynu, i postukaj płytką o papier chłonny, aby zapewnić usunięcie nadmiaru płynu.
- Dodać 25 μl głównej mieszanki do barwienia powierzchni do każdego dołka i delikatnie wymieszać za pomocą pipety, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 min.
nuta: Aby przygotować główną mieszankę do barwienia powierzchni dla pojedynczego dołka, należy dodać 2,5 μl powierzchniowego mAb do 20 μl buforu FACS.
- Dodać 200 μl buforu FACS do studzienki i odwirować przy 1 400 × g przez 5 minut. Po odwirowaniu opróżnij studzienki z płynu przez dekantację i postukaj płytką o papier chłonny, aby usunąć nadmiar płynu.
- Dodać 100 μl roztworu barwiącego L/D do dołka. Dokładnie wymieszać za pomocą pipety, a następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
nuta: W przypadku pojedynczego dołka rozpuść 0,25 μl barwnika L/D w 100 μl buforu FACS. Barwnik L/D pomaga odróżnić żywe i martwe komórki.
- Dodać 100 μl buforu FACS. Przykryj studzienki pokrywką i odwiruj płytkę o masie 1 400 × g przez 5 minut. Odlać supernatant przez dekantację i uderzyć płytką w chłonny papier.
- Powtórz krok 4.1.11.
- Dodać 50 μl roztworu utrwalającego do dołka (dostarczonego z zestawem) i wymieszać pipetą przed inkubacją płytki w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut.
- Dodać 150 μl 1x buforu do przemywania permeabilizacji (PW) dostarczonego z zestawem i przykryć studzienki pokrywką.
nuta: Aby przygotować 10 ml 1x buforu PW, rozcieńczyć 1 ml 10x buforu do trwałej ondulacji w 10 ml dH2O.
- Odwirować płytkę o sile 1 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez dekantację i postukanie płytki o bibułę chłonną.
- Dodać 200 μl 1x PW, a następnie odwirować w stężeniu 1 400 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatant przez dekantację i postukać płytką w papier chłonny.
- W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego dodać 25 μl głównej mieszanki barwienia wewnątrzkomórkowego (anty-ludzki Ki-67 mAb) na studzienkę. Dobrze wymieszać i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C lub na lodzie w ciemności.
nuta: Aby przygotować wewnątrzkomórkową mieszankę wzorcową barwienia dla pojedynczego dołka, dodaj 1 μl Ki-67 mAb do 24 μl 1x PW. Wewnątrzkomórkowy marker barwienia jest używany tylko podczas przetwarzania komórek od kohodowli w 16 dniu. Barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wykonywane podczas przetwarzania PBMC, naiwnych limfocytów, monocytów i naiwnych MoDC.
- Po inkubacji dodać 200 μl 1x PW do każdej studzienki. Mieszać pipetą i odwirowywać przez 1 400 × g przez 5 min. Odlać supernatant przez dekantację i uderzyć płytką w chłonny papier.
- Dodać 200 μl buforu FACS, a następnie odwirować w stężeniu 1 400 × g przez 5 minut. Odlać supernatant przez dekantację i postukać płytką o chłonny papier.
- Zawiesić osad komórkowy w 200 μl buforu FACS i przenieść zawartość każdej studzienki do oddzielnych sterylnych probówek cytometru przepływowego. Użyj 300 μl buforu FACS na studzienkę, aby zebrać pozostałe komórki. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej.
- Badanie próbki na cytometrze przepływowym
nuta: Próbki badano na cytometrze przepływowym (przy użyciu laserów o długości fali 488 nm, 638 nm i 405 nm) zgodnie z instrukcją producenta. Zapoznaj się z instrukcją, aby uzyskać szczegółowe informacje, rozwiązywanie problemów i dostosowywanie protokołu.
- Wykonaj rutynowe procedury czyszczenia przed i po odczytaniu próbek.
nuta: Nie pomijaj pozycji podczas ładowania rurek w instrumencie.
- Do cyklu czyszczenia należy użyć łącznie czterech probówek, z których pierwsza zawiera odczynnik do czyszczenia przepływowego, a pozostałe trzy probówki zawierają dH2O; każda probówka będzie miała 3 ml. Podczas czyszczenia należy pozyskiwać dane o średnim natężeniu przepływu przez około 1 minutę, rejestrując 100 000 zdarzeń na rurę poniżej 330 V dla rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z 265 V dla rozproszenia bocznego (SSC).
nuta: Podczas czyszczenia nie należy zgłaszać żadnych zanieczyszczeń ani zdarzeń komórkowych; Jeśli tak się stanie, ponownie wykonaj krok czyszczenia. W przypadku uruchamiania próbek należy upewnić się, że wszystkie próbki znajdują się w jednorodnej zawiesinie przed uzyskaniem danych, ponieważ zapewnia to dokładny odczyt.
- Aby podłączyć i włączyć cytometr, kliknij przycisk aplikacji znajdujący się w lewym rogu paska tytułu. Z menu rozwijanego aplikacji wybierz opcję Cytometria i kliknij opcję Power On.
nuta: Z menu rozwijanego aplikacji opcja Otwórz umożliwia użytkownikom przeglądanie wstępnie zaprogramowanych testów, podczas gdy opcja Nowy protokół umożliwia użytkownikom tworzenie nowych protokołów.
- Początkowo załadować próbkę kontroli ujemnej do uchwytu wieloprobówkowego. Wybierz pozycję Nowy protokół i obserwuj listę roboczą po lewej stronie obszaru roboczego/ekranu.
- Na liście roboczej zdefiniuj pozycję próbki w uchwycie wieloprobówkowym oraz nadaj nazwę próbce i protokół identyfikacji.
- Z panelu sprzętowego znajdującego się po lewej stronie obszaru roboczego dostosuj i wybierz wiele parametrów, takich jak detektory (FSC, SSC i 10 zakresów fluorescencji), napięcia (V) i wzmocnienia fotopowielaczy oraz obszar-wysokość-szerokość (AHW) sygnału.
nuta: Na podstawie użytego eksperymentu i przyrządu wybrano następujące ustawienia dla detektorów: FSC-AHW: AHW, V: 270, G: 5; SSC-AHW: A, V: 350, G: 10; FL1 (CD8/FITC Dextran)-AHW: A, V: 400, G: 1; FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1; FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1; FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1; FL9 (L/D)-AHW: A, V: 425, G: 1.
- Na panelu sterowania akwizycji przyrządów znajdującym się pod paskiem tytułu dostosuj opcje natężenia przepływu (średnie), czasu (5 min) i zdarzeń (patrz krok 5.2.8), które mają być wykrywane. Kliknij opcję Acquire Single, aby umożliwić instrumentowi pobranie/uruchomienie próbki i pokazanie podglądu wykrytych zdarzeń w czasie rzeczywistym.
- Z podglądu w czasie rzeczywistym dostosuj próg fluorescencji (napięcie i wzmocnienie) oraz rozmiar komórki, aby ostatecznie narysować bramki wokół żądanej populacji komórek, wykluczając wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
nuta: FSC pomaga rozróżniać komórki na podstawie wielkości, umożliwiając w ten sposób użytkownikom różnicowanie komórek układu odpornościowego, takich jak monocyty i limfocyty; monocyty są większe i wykazują wyższą intensywność FSC w porównaniu z limfocytami.
- Zdobądź łącznie około 5 000 żywych MoDC, 50 000 żywych limfocytów i 50 000 żywych monocytów.
- Gdy wszystkie parametry zostaną dostosowane w odniesieniu do ujemnej próbki kontrolnej, kliknij Stop i zapisz protokół.
- Teraz załaduj wszystkie próbki do ładowarki wielorurowej. Zdefiniuj każdą próbkę na liście roboczej i zastosuj parametry dostosowane w odniesieniu do kontroli ujemnej do wszystkich próbek w eksperymencie. Kliknij opcję Pobierz, aby zezwolić na kolejno uruchamianie wszystkich próbek w eksperymencie.
- Po pozyskaniu danych ze wszystkich próbek zapisz je i przekształć w czytelne dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy danych, które umożliwia generowanie sekwencyjnych histogramów dwuparametrycznych i monoparametrycznych.