Test zaburzeń hemocytów w celu oceny readhezji hemocytów do kieszonek krwiotwórczych

Streszczenie

Źródło: Petraki, S. et al., Astesting Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.J. Vis. Exp.(2015)

Ten film demonstruje test zaburzeń hemocytów, oceniając ponowne przyleganie hemocytów do kieszeni krwiotwórczych larw Drosophila. Zakłócenia mechaniczne uwalniają rezydujące hemocyty, podnosząc liczbę krążących hemocytów. Po wyzdrowieniu potwierdza się ponowne przyleganie rezydentnych hemocytów, co ilustruje odwracalność.

Protokół

1. Test krwawienia/skrobania hemocytu

1. Przygotowanie preparatów:
   1. Opcja 1 dla mikroskopów bez funkcji skanowania płytek: Dla każdej larwy do analizy należy przygotować jedno szklane szkiełko z około 5 dołkami Pap-pen o kwadratach 2 mm każda, odpowiadającymi obszarowi widzenia pola mikroskopu; dodać około 5 - 10 μl pożywki S2 do każdej (ryc. 1A). Szkiełka należy przechowywać w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysychaniu studzienek.
   2. Opcja 2 dla mikroskopów z funkcją skanowania kafelkowego: Dla każdej larwy, która ma być analizowana, należy przygotować jedno szklane szkiełko z 3 do 4 dołkami Pap-pen o kwadratach ~3 - 4 mm każdy; dodać około 15 - 20 μl pożywki S2 do każdej studzienki (ryc. 1B). Szkiełka należy przechowywać w wilgotnej komorze, aby zapobiec wysychaniu studzienek.
      nuta: Zalecana powyżej liczba studzienek jest wystarczająca dla sumy do 3000 hemocytów na larwę (późne larwy w drugim^{stadium rozwojowym}, ~2,5 - 3 mm długości, transgen znakujący większość larwalnych krwinek). Podczas oceny większej liczby krwinek może być potrzebnych więcej studzienek, aby uniknąć przepełnienia.
2. Zbieranie larw:
   1. Wlej wodę do fiolki z muchami zawierającej larwy i spłucz larwy na szalkę Petriego lub nabierz trochę pokarmu zawierającego larwy na szalkę Petriego i rozcieńcz wodą za pomocą butelki ze spryskiwaczem.
   2. Delikatnie wydłub larwy z szalki Petriego za pomocą pędzla i umieść je w wodzie w naczyniu z jamą lub na szkiełku na zimnym bloku.
      nuta: Larwy można przechowywać przez ograniczony czas w wodzie lub na zimnym bloku; Używaj próbek w ciągu 45 minut lub krócej, aby uniknąć śmierci larw lub niepożądanego wpływu na hemocyty.
3. Rozwarstwienie:
   1. Wybierz larwy pod mikroskopem fluorescencyjnym na zimnym metalowym bloku. W razie potrzeby zmierz rozmiary i larwy obrazu.
   2. Izolacja krążących hemocytów ("Krwawienie"):
      1. Po wybraniu larw umieść jedną larwę w pierwszej studzience Pap-pen (ryc. 1C, 2A).
      2. Użyj 2 czystych igieł lub nożyczek i kleszczy, aby wykonać nacięcie zarówno na tylnym, jak i przednim końcu larwy. Aby uniknąć zakłócania przebywających hemocytów, najlepiej jest wykonać te nacięcia po brzusznej stronie larwy. Aby uzyskać spójne wyniki, wykonaj nacięcia w tych samych miejscach dla każdej larwy. W przypadku 1^{larwy w} stadium rozwojowym wystarczy 1 nacięcie (w przedniej części brzusznej).
      3. Pozwól larwie krwawić przez kilka sekund bez żadnego nacisku lub fizycznego pobudzenia (ryc. 2A).
         nuta: W przypadku pracy na wielu larwach lepiej jest wykonać te nacięcia dla każdej z nich przed przejściem do następnego kroku, aby uniknąć zbyt długiego trzymania larw na lodzie, co mogłoby wpłynąć na integralność próbek.
      4. Delikatnie podnieś larwę za pomocą igieł lub kleszczy i zanurz ją w drugiej studzience, aby spłukać pozostałe krążące hemocyty. Następnie nastąpi uwolnienie rezydentnych hemocytów.
   3. Izolacja rezydentnych hemocytów ("Scrape"):
      1. Delikatnie przenieś larwę do następnej studzienki (ryc. 2C).
      2. Zidentyfikuj gruczoł limfatyczny larwy, który zazwyczaj znajduje się około 1/3 od przedniego końca larwy i który może fluoryzować grzbietowo przez ścianę ciała larwy. Omijaj gruczoł limfatyczny, uwalniając rezydujące hemocyty, przygwożdżając larwę igłą jak najbliżej gruczołu limfatycznego, aby uniknąć nakłucia (ryc. 2C).
         nuta: Podczas normalnego rozwoju dojrzewanie hemocytów gruczołów limfatycznych jest opóźnione w porównaniu z hemocytami larw, a fluorescencyjne reportery zróżnicowanych hemocytów mogą nie wykazywać sygnału w gruczołach chłonnych młodych larw. W takich przypadkach należy zwracać mniejszą uwagę na gruczoł limfatyczny, ponieważ nie przewiduje się zanieczyszczenia zróżnicowanych, znakowanych fluorescencyjnie hemocytów larwalnych hemocytami gruczołów limfatycznych.
      3. Uwolnij rezydujące komórki krwi w procesie preparacji polegającym na skrobaniu i/lub dźganiu. Użyj jednej igły, aby skutecznie przygwoździć larwę w pobliżu gruczołu limfatycznego (patrz wyżej) lub innych obszarów ciała w razie potrzeby. Użyj innej igły, aby nakłuć skupiska hemocytów, które są widoczne przez ścianę ciała larwy (ryc. 2C, E), mając na celu oddzielenie hemocytów. Hemocyty mogą być również uwalniane w ruchu skrobania. Jednak wczesne rozerwanie naskórka może uwolnić duże skupiska krwinek, co może utrudnić automatyczne liczenie.
         nuta: W zależności od wieku i genotypu larwy liczba całkowitych hemocytów będzie się różnić. Opisany powyżej proces uwalniania należy rozdzielić na kilka dołków, aby uniknąć przepełnienia niektórych studzienek krwinkami, co mogłoby utrudnić analizę obrazu pojedynczej komórki.
      4. Jeśli w końcowej tuszy pozostało niewiele hemocytów, policz te hemocyty poprzez obserwację przez mikroskop i użycie ręcznego licznika zliczającego (ryc. 2E). Aby ułatwić liczenie, umieść tuszę na czystej powierzchni tego samego szkiełka i rozprowadź ją tak cienko, jak to możliwe, aby zmniejszyć liczbę płaszczyzn optycznych.
      5. Po zakończeniu sekcji odczekaj od 5 do 10 minut, aż komórki osiądą (ale niekoniecznie przylegają) przed obrazowaniem studzienek. Inkubuj szkiełko w wilgotnej komorze, aby uniknąć wysuszenia i unikaj nieostrożnego obchodzenia się ze szkiełkami, które mogłoby zakłócić osiadłe hemocyty.
         nuta: Podczas oznaczania liczby hemocytów uwolnione komórki nie są utrwalane i komórki muszą być zobrazowane wkrótce po sekcji, najlepiej w ciągu 30 minut po uwolnieniu z larwy. W zależności od objętości pożywki i właściwości komórek, zdecydowana większość komórek osiądzie w ciągu 5 - 10 minut, co należy potwierdzić poprzez skupienie przez płaszczyzny optyczne pożywki w studzience. Jednak do tego czasu tylko część komórek krwi przylgnie do powierzchni szkiełka, co należy wziąć pod uwagę przy modyfikowaniu tego protokołu dla podejść opartych na fiksacji komórek.
4. Kwantyfikacji:
   1. Zrób zdjęcia osiadłych hemocytów pod mikroskopem fluorescencyjnym (ryc. 2B, D, F). Następnie wykonaj kwantyfikację hemocytów za pomocą oprogramowania ImageJ.
   2. Przygotuj obraz dla algorytmu zliczania komórek ImageJ:
      1. Otwórz obraz studni za pomocą ImageJ: File → Otwórz → (zlokalizuj plik i wybierz).
      2. Upewnij się, że obrazy są 8-bitowe lub 16-bitowe. Dostosuj próg obrazu, wybierając opcję Obraz, a następnie kliknij przycisk Dostosuj i wybierz opcję Próg. Zwróć uwagę na "Okno progowe" (Rysunek 3A).
      3. Zaznacz opcję "Ciemne tło". Wybierz "Czerwony" i zwiększaj dolny poziom progu (patrz strzałka), aż każda komórka na obrazie zostanie oznaczona czerwoną kropką (komórki, które nie są zakryte, będą widoczne w skali szarości; Rysunek 3B). Wraz ze wzrostem dolnego progu niektóre komórki staną się nieoznaczone. Może to być wskaźnik tego, jak daleko należy ustawić dolny próg.
         nuta: Czasami skupiska komórek nie mogą być rozdzielone i są liczone jako jedna przez licznik cząstek. W takich przypadkach liczbę komórek w klastrze można oszacować, badając obraz (w razie potrzeby powiększając) i ręcznie zliczając za pomocą licznika tally. Alternatywnie dolny próg można zwiększyć, aby rozdzielić klastry komórek; Wszystkie nieoznaczone komórki powstałe w wyniku tej manipulacji można następnie policzyć za pomocą licznika zliczeń.
   3. Analizuj numer komórki za pomocą ImageJ:
      1. Uruchom analizator cząstek, aby policzyć komórki (Rysunek 3C). Wybierz opcję Analizuj i kliknij opcję Analizuj cząstkę. Opcjonalnie wybierz opcję "Nakładaj kontury", aby zobaczyć cząstki zliczane przez algorytm (rysunek 3D). Alternatywnie ustaw limit rozmiaru lub obszaru pikseli jednostki (np. komórki, zlepka komórek itp.), aby algorytm miał zliczać.
      2. Kliknij przycisk OK. Obserwuj okno podsumowania z liczbą (Rysunek 3E).

2. Test zaburzeń hemocytów

1. Aby zakłócić działanie hemocytów, wybierz larwy i umieść je w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z około 0,5 g szklanych kulek (212 - 600 μm) i dodaj 0,5 ml wody.
2. Obracaj rurkę ręcznie z prędkością 10 przez 1 minutę.
3. Wyjmij larwy ze szklanych kulek, rozlewając zawartość probówki mikrowirówkowej na szalkę Petriego i wybierając larwy pędzlem.
4. W fazie rekonwalescencji larwy należy umieścić na wcześniej przygotowanych szalkach Petriego z niewielką ilością pokarmu dla much. Pozwól larwom na przywrócenie wzorca hemocytów przez okres 45 minut lub zgodnie z życzeniem.
   nuta: Wyrzuć wszystkie larwy, które przestały się poruszać, ponieważ obumarły w tym procesie. Jednak zazwyczaj widzimy niewielkie uszkodzenia po 1 minucie wirowania.
5. Po okresie rekonwalescencji kontynuuj test krwawienia/skrobania, jak opisano powyżej w sekcji 1.

Wyniki

Rysunek 1. Konfiguracja i schemat testu krwawienia/skrobania i zakłóceń hemocytów. orazKonfiguracja szkiełek z pojedynczym obrazem: pięć kwadratów 2 mm do obrazowania za pomocą obiektywu 5X. (B) Konfiguracja szkiełek do skanowania kafelków: cztery kwadraty 3 mm do obrazowania krwawienia/zadrapań larw o średnicy ≤2,5 mm za pomocą mikroskopu skanującego płytki. Zalecane obiektywy do o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
szalki Petriego 6 cm/9 cm			Po jednym dla każdego genotypu, który ma być oceniany
Butelka ze spryskiwaczem wody
Metalowa łyżka/szpatułka
Cienki pędzel			np. "wkładka"
Naczynie ze szklaną wnęką
Pióro PAP: Super PAP PEN IM3580	Beckman Coulter
Szkiełka szklane			Na każdym slajdzie będzie narysowanych 5 lub więcej kwadratów PAP PEN. Rozmiar kwadratów zależy od obiektywu obrazowania i powiększenia kamery mikroskopowej; np. kwadraty 2mm.
Komora wilgotnościowa			Zostanie to wykorzystane, aby zapobiec wysychaniu szkiełek i studzienek: szczelny pojemnik z mokrymi ręcznikami papierowymi wyściełającymi boki/dno
Pożywki do hodowli komórek Drosophila Schneidera	Invitrogen
Zimny blok			Jest to metalowy blok (inaczej blok grzewczy) schłodzony w wiadrze zawierającym lód; najlepiej w kolorze czarnym lub innym, nieodblaskowym kolorze
Dwie strzykawki 1ml z igłami (27G 1/2)	Becton Dickinson		Do sekcji.
Opcjonalnie: chirurgiczne nożyczki sprężynowe (krawędź tnąca 2 mm)	Narzędzia naukowe
Koraliki szklane, 212-600 mikronów	Sigma
Probówki Eppendorf 2 ml	Eppendorf		Jedna ocena na genotyp
Mieszalnik wirowy	Fisher Naukowy
Transgeniczne larwy Drosophila z fluorescencyjnie oznaczonymi hemocytami. Odpowiednie transgeny obejmują: HmlΔ-DsRed (Makhijani i wsp., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi i wsp., 2009), BcF6-CFP i -GFP (Gajewski i wsp., 2007) lub HmlΔ-GAL4 (Sinenko i Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer i wsp., 2005), He-GAL4 (Zettervall i wsp., 2004), Crq-GAL4 (H. Agaisse (Stramer i wsp., 2005)) lub eater-GAL4 (Tokusumi i wsp., 2009) w połączeniu z UAS-GFP lub innymi transgenami białek fluorescencyjnych.
Fluorescencyjny mikroskop preparacyjny	Księga Leica		Tutaj: Leica M205, opcjonalnie z aparatem, oprogramowaniem do obrazowania i modułem pomiarowym
Odwrócony mikroskop fluorescencyjny z mocowaniem kamery	Leica lub Keyence		Z funkcją skanowania kafelków lub bez (np. Seria Leica DMI, seria Keyence BIOREVO BZ-9000)

powiedział: powiedział: