Technika barwienia tetramerów peptydowych MHC-I do analizy komórek T pamięci CD8 + specyficznych dla SIV

Streszczenie

Źródło: Gonzalez-Nieto, L., et al. Analiza limfocytów T CD8⁺ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności u makaków rezusów za pomocą barwienia tetramerów peptydowo-MHC-I. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje metodę charakteryzowania limfocytów T pamięci CD8⁺ specyficznych dla małpiego wirusa niedoboru odporności (SIV) przy użyciu tetramerów peptydowo-głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (pMHC-I). Tetramer pMHC-I to kompleks czterech cząsteczek MHC-I związanych z peptydami specyficznymi dla SIV i sprzężonych z fluoroforem. Te tetramery selektywnie wiążą się z receptorami limfocytów T (TCR) na limfocytach T CD8 ⁺ specyficznych dla SIV, ułatwiając charakterystykę tych komórek.

Protokół

1. Leczenie PKI

UWAGA: To jest opcjonalne, ale zalecane dla tetramerów Mamu-B*017:01.

1. Zawiesić PBMC w pożywce R10 w stężeniu 1,6 x 10⁷ komórek/ml.
2. Dodać 50 μl tej zawiesiny komórkowej do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Do każdej probówki dodać 50 μl roztworu PKI o stężeniu 100 nM.
3. Wiruj każdą rurkę. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Pod koniec tego kroku każda probówka powinna mieć 100 μl zawiesiny komórki zawierającej 8,0 x 10⁵ PBMC i 50 nM PKI.
4. Przejdź do etapu barwienia tetramerem pMHC-I.

2. Barwienie tetramerami pMHC-I znakowanymi fluorochromem

1. Przed przygotowaniem głównej mieszanki tetrameru pMHC-I należy odwirować probówki tetrameru pMHC-I o stężeniu 20 000 x g przez co najmniej 15 minut w temperaturze 4 °C. Celem tego etapu jest osadzenie agregatów białkowych w roztworze tetrameru pMHC-I, które mogą zwiększać barwienie tła. Po zakończeniu etapu wirowania należy unikać pipetowania od dna probówki, w której nagromadzą się agregaty białkowe.
2. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki tetramerów pMHC-I, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne. Przygotować nadmiar 15% całkowitej objętości tej mieszanki wzorcowej, aby uwzględnić błędy pipetowania.
3. Rozcieńczyć tetramery pMHC-I w buforze barwiącym (np. Brilliant Stain Buffer) tak, aby do każdego badania dodać 25 μl głównej mieszaniny tetrameru pMHC-I.
   1. Oznaczyć PBMC dwoma tetramerami pMHC-I na test; jeden sprzężony z allofikocyjaniną (APC), a drugi z fioletem brylantowym (BV) 421.
4. Dodać 8,0 x 10⁵ PBMC do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej w końcowej objętości 100 μl. Jeśli komórki zostały poddane opisanej powyżej obróbce infrastrukturą kluczy publicznych, na tym etapie powinny być już ponownie zawieszone w 100 μl.
5. Dodać 25 μl głównej mieszanki tetrameru pMHC-I do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Pod koniec tego etapu końcowa objętość w każdej probówce powinna wynosić 125 μl.
6. Wirować każdą probówkę w celu homogenizacji zawiesiny komórek.
7. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Podczas tej 45-minutowej inkubacji przygotować koktajl przeciwciał monoklonalnych (mAb) barwiących powierzchniowo.

3. Barwienie powierzchni

1. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki mAb, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne. Przygotować nadmiar 15% całkowitej objętości tej mieszanki wzorcowej, aby uwzględnić błędy pipetowania.
2. Dostosuj objętość mieszanki wzorcowej z buforem barwiącym tak, aby dodać 50 μl na test.
3. W celu prawidłowego wykluczenia limfocytów T innych niż CD8 ⁺ i wyznaczenia podzbiorów pamięci, należy użyć miareczkowanych ilości mAb skierowanych przeciwko następującym cząsteczkom w mieszance głównej barwienia powierzchni.
   nuta: Jako odniesienie podano fluorochromy sprzężone z każdym mAb: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7 i CCR7 FITC. Zauważ, że mAb przeciwko CD14, CD16 i CD20 są sprzężone z tym samym fluorochromem (tj. BV 510), ponieważ zostaną włączone do bramki "zrzutu".
4. Dołączyć barwnik utrwalający do rozróżniania martwych komórek w głównej mieszance barwienia powierzchni [tj. barwnik reagujący aminami (ARD)]. Upewnij się, że odczynnik ARD jest sprzężony z fluorochromem o podobnym widmie emisyjnym, jak te używane w bramce "zrzutowej". W takim przypadku użyj ARD Aqua.
5. Dodać 50 μl wzorcowej mieszanki barwiącej opisanej w ppkt 3.1-3.4 do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Pod koniec tego etapu końcowa objętość w każdej probówce powinna wynosić 175 μl.
6. Wiruj każdą rurkę. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 25 minut.
7. Przemyć komórki buforem płuczącym (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) zawierający 0,1% albuminy surowicy bydlęcej i 0,45 g/l NaN3).
   ostrożność: Azydek sodu (NaN₃) jest substancją toksyczną. Narażenie nawet na niewielkie ilości może powodować objawy. Z tą substancją należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi określonymi przez Biuro ds. Bezpieczeństwa i Higieny Pracy (EHS) w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty.
8. Probówki wirówkowe o masie 510 x g przez 5 min. Ostrożnie zdekantować supernatant do oddzielnego pojemnika na odpady. Uważaj, aby nie naruszyć pelletu.
   ostrożność: Nie należy dekantować supernatantu buforowego do zbiorników zawierających wybielacz, ponieważ może on reagować z azydkiem sodu obecnym w buforze do przemywania i powodować powstawanie toksycznego gazu. Skontaktuj się z Biurem BHP w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty, aby uzyskać wskazówki dotyczące utylizacji azydku sodu.
9. Po zdekantacji zwiruj komórki w pozostałej cieczy zatrzymanej w każdej probówce.

4. Utrwalenie komórek

1. Dodać 250 μl 2% roztworu paraformaldehydu (PFA) do wszystkich probówek, aby utrwalić komórki.
   UWAGA: PFA jest substancją toksyczną. Narażenie nawet na niewielkie ilości może powodować objawy. Z substancją tą należy obchodzić się zgodnie z wytycznymi określonymi przez Biuro BHP w instytucji, w której przeprowadzane są te eksperymenty.
   1. Ponieważ 2% roztwór PFA musi być izotoniczny dla komórek, do przygotowania tego roztworu należy użyć PBS. Sto mililitrów 2% roztworu PFA wystarcza do wielu eksperymentów. Natychmiast po dodaniu 2% PFA należy dokładnie wywirować wszystkie probówki, aby zapobiec tworzeniu się agregatów komórkowych.
2. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 20 minut.
3. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9. Po zakończeniu tego etapu ogniwa można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez 24-48 godzin. Przed przystąpieniem do fazy permeabilizacji dokładnie wymieszaj rurki.

5. Przepuszczalność komórek

1. Dodać 500 μl buforu przepuszczalnego. Zwiruj wszystkie rurki.
2. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
3. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9.

6. Barwienie wewnątrzkomórkowe

1. Przygotuj wystarczającą ilość głównej mieszanki mAb, aby zabarwić wszystkie probówki eksperymentalne.
2. Dostosuj objętość za pomocą PBS lub buforu barwiącego tak, aby dodać 50 μl wewnątrzkomórkowej mieszanki głównej mAb na test.
3. Przygotować główną mieszaninę mAb opisaną w ppkt 6.1 i 6.2, stosując domiarkowane ilości mAb skierowane przeciwko CD3 i granzymowi B (Gzm B).
   nuta: Zaangażowanie TCR przez tetramery pMHC-I może powodować internalizację CD3, która może zakłócać wykrywanie limfocytów T tetrameru + CD3 ⁺ CD8 ⁺, jeśli mAb anty-CD3 zostanie dodany do głównej mieszanki barwienia powierzchni. Aby tego uniknąć, dodaj mAb anty-CD3 na tym etapie, czyli po przepuszczalności komórek. Fluorochromy sprzężone z każdym mAb są wymienione jako odniesienie: CD3 PerCP Cy5.5 i Gzm B PE.
4. Dodaj 50 μl koktajlu mAb do odpowiednich probówek. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
5. Umyj komórki, powtarzając kroki 3.7-3.9. Probówki są gotowe do pobrania w cytometrze przepływowym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dazatynib	Axon medchem	Axon 1392	Musi być ponownie zawieszony w DMSO i natychmiast przechowywany w temperaturze -20°C
RPMI z Glutamax	gibco/ Technologie Życia	Nr kat. 61870-036	Musi być przechowywany w temperaturze 4 °C
FBS inaktywowany termicznie	gibco/ Technologie Życia	Numer katalogowy 10082-147	Musi być przechowywany w temperaturze 4 °C
Penicylina-Streptomycyna-Amfoterycyna B	Lonza	17-745E	Musi być przechowywany w temperaturze 4 °C
DMSO, bezwodny	Technologie życiowe	Zobacz materiał D12345	Przechowywać w temperaturze pokojowej.
5-mililitrowe probówki polipropylenowe z okrągłym dnem	Firma VWR	Nr kat. 60819-728
Tetramery pMHC-I sprzężone z fluorochromem	Rdzeń tetramerowy NIH lub MBL, Inc.		Musi być przechowywany i utrzymywany w temperaturze 4 °C. Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut przed użyciem. Nie zamrażać.
MAb sprzężone z fluorochromem	Różne firmy		Musi być przechowywany i konserwowany w temperaturze 4 °C. Nie zamrażać.
LIVE/DEAD Zestaw do naprawy Aqua Dead Cell Stain Kit	Technologie życiowe	L34957	Musi być przechowywany w temperaturze -20 °C. Przed użyciem zawiesić każdą porcję w 50 μl DMSO.
Genialny bufor plam	BD Nauki biologiczne	563794	Musi być przechowywany w temperaturze 4 °C
sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Firma VWR	Numer katalogowy: 97064-158	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Albumina bydlęca	Firma VWR	Nr kat. 700011-230	Musi być przechowywany w temperaturze 4 °C
Azydek sodu	Firma VWR	Numer katalogowy: 97064-646	Przechowywać w temperaturze pokojowej. Substancja toksyczna. Nie mieszać z wybielaczem.
wybielacz	Firma VWR	Numer katalogowy: 89501-620	substancja chemiczna, nie może być mieszana z azydkiem sodu. Obchodź się ostrożnie
Paraformaldehyd	Nauki o mikroskopii elektronowej	15714-S	Odczynnik łatwopalny, i toksyczny. Obchodź się ostrożnie
Polisorbat 20 (Tween-20)	Alfa Aesar	L15029	Przechowywać w temperaturze pokojowej
Roztwór przepuszczalności 2	BD Nauki biologiczne	340973	Odczynnik toksyczny i. Obchodź się ostrożnie
Probówki Sarsdet 1,5 ml z zakrętką	Firma VWR	72.692.005
2,0 ml probówek o niskim poziomie wiązania DNA / RNA	Eppendorf	22431048	Preferowane jest stosowanie sterylnych mikroprobówek
Mieszalnik wirowy
Szafa bezpieczeństwa biologicznego
System uzdatniania wody Milli Q Intergral	EMD Milipore	ZRXQ010WW	Można używać wody klasy biologii molekularnej od dowolnego dostawcy
Mikrowirówka
wirówka
Lodówka 4 °C
BD LSR II	BD Nauki biologiczne		Cytometr przepływowy musi zawierać lasery i filtry, które są kompatybilne z zastosowanym panelem barwiącym.
Dejonizowana
Folia aluminiowa	FIRMA VWR SCIENTIFIC INC.	Numer katalogowy: 89068-738
inkubator			Musi być w stanie utrzymać temperaturę wewnętrzną na poziomie 37 °C
Oprogramowanie FACS Diva	BD Nauki biologiczne
Oprogramowanie Flowjo w wersji 9.6	Flowjo		Służy do analizy plików FCS generowanych przez oprogramowanie FACS Diva
Końcówki do mikropipet

powiedział: powiedział: