$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Znakowanie fluorescencyjne i perfuzja leukocytów (PMN lub THP-1 dla ludzkich i RAW264.7 lub pierwotnych monocytów myszy do mysiego testu opartego na przepływie)
- Etykietowanie fluorescencyjne
- Oznacz leukocyty (1 x 106 / ml) za pomocą przepuszczalnego dla komórki zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego (1 μM). Inkubować komórki przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Przemyć komórki PBS przez odwirowanie przy 300 x g przez 5 minut i zawiesić komórki do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml (5 ml na warunki badania, w zależności od szybkości przepływu) w buforze do oznaczania.
- Przygotowanie testu w komorze przepływowej
- W celu adhezji leukocytów na monowarstwie komórkowej należy wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej z naczynia i złożyć ją w komorze przepływowej. Podłączyć rurkę do strzykawki. W celu uzyskania adhezji leukocytów na unieruchomionych płytkach krwi należy podłączyć mikroszkiełko do strzykawki. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C.
- Weź strzykawkę perfuzyjną (50 ml), zainstaluj strzykawkę na uchwycie strzykawki i ustaw pompę w trybie wycofania. Ustawić objętość pompy na 0 ml i ustawić średnicę na 26,70 mm dla strzykawki 50 ml.
- Podłącz kolankowe złącze luer do jednego końca rurki. Umieścić złączkę typu luer lock w strzykawce i połączyć rurkę z kolankowym złączem luer ze złączką luer lock. Podłącz wolny koniec rurki do komory przepływowej.
- Perfuzja i adhezja leukocytów
- W celu adhezji leukocytów na monowarstwie komórkowej należy wyrzucić pożywkę do hodowli komórkowej z naczynia i złożyć ją w komorze przepływowej. Podłączyć rurkę do strzykawki. W celu uzyskania adhezji leukocytów na unieruchomionych płytkach krwi należy podłączyć mikroszkiełko do strzykawki.
- W celu perfuzji i adhezji leukocytów na monowarstwie naczyń krwionośnych lub płytek krwi, umieść drugą rurkę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej bufor do oznaczania i napełnij rurkę pipetą o pojemności 1 ml, a następnie ściśnij rurkę i podłącz ją do komory przepływowej.
- Przed perfuzją leukocytów dodać 3 mM CaCl2 i 2 mM MgCl2 do zawiesiny komórek i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Bufor do oznaczania perfuzji przed perfuzją komórek w celu usunięcia ewentualnego powietrza z komory i przewodów.
- Zamknij końce probówek, ściskając je mocno i zmieniając rurkę z bufora testowego na zawiesinę komórek, zapobiegając uwięzieniu pęcherzyków powietrza. Perfuzjuj komórki z odpowiednim natężeniem przepływu/naprężeniem ścinającym, aż pojawią się pierwsze komórki.
- Perfekować komórki o odpowiednim natężeniu przepływu/naprężeniu ścinającym przez 2 minuty i uchwycić co najmniej 6 zdjęć w ciągu 2–6 minut toczących się i przylegających komórek za pomocą mikroskopu kontrastowego/fluorescencyjnego z odwróconą fazą (np. EVOS-FL) przy użyciu 100-krotnego powiększenia podłączonego do cyfrowej kamery CCD lub CMOS.
UWAGA: Natężenie przepływu/naprężenie ścinające zależy od wymiarów komory przepływowej i lepkości perfuzatu. Dla zastosowanej tutaj komory perfuzyjnej (patrz tabela materiałów):
τ=η*97,1*Φ
τ: naprężenie ścinające (1 dyn / cm2)
η: lepkość (0,015 dyn*s/cm2)
Φ: Natężenie przepływu (0,67 ml/min)
- Usuwanie adhezji leukocytów
- W celu usunięcia adhezji należy zmienić rurkę z zawiesiny komórek na bufor testowy, ściskając rurkę, zapobiegając uwięzieniu pęcherzyków powietrza.
- Odłączyć komórki przez perfuzję za pomocą buforu do oznaczania o odpowiednim natężeniu przepływu/naprężeniu ścinającym (patrz uwaga 3.3.7).
- Transmigracja leukocytów
- W przypadku transmigracji leukocytów należy perfuzjować leukocyty (krok 3), aż do przylegania odpowiedniej ilości leukocytów (~50 komórek/pole widzenia).
- Zastąp zawiesinę leukocytów buforem testowym.
- Rejestruj transmigrujące komórki poklatkowo co 10–15 s przez 30–60 minut w temperaturze 37 °C.