$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Wytwarzanie nanostruktur
- Jako podłoża do nanowytwarzania należy wybrać szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm i przybliżonej grubości 170 μm (nr 1,5).
- Zanurz szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1) na co najmniej 6 godzin. Umyj szkiełko nakrywkowe nasączone piranią dużą ilością ultraczystej dejonizowanej wody destylowanej (DDW) o mocy 18,2 MΩ.
ostrożność: Kwas piranii gwałtownie reaguje z materiałami organicznymi i należy się z nim obchodzić z najwyższą ostrożnością.
- Osadzanie cienkiej warstwy chromu o długości fali 10 nm na szkiełkach nakrywkowych poprzez odparowanie wiązką elektronów, aby uniknąć efektów ładunku podczas modelowania i obrazowania nanostruktur.
- Wirować pierwszą warstwę dwuwarstwowego rezystu składającego się z kopolimeru mleczanu etylu i metakrylanu metylu (MMA_EL6) z prędkością 2 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 150 °C. Drugą warstwę polimetakrylanu metylu (950PMMA_A2) wirować przy 3 000 obr./min przez 45 sekund, a następnie piec w temperaturze 180 °C.
- Wzór rezystu dwuwarstwowego za pomocą litografii wiązką elektronów (EBL) przy napięciu 25 kV przy dawce powierzchniowej 300 μC/cm2. Wywołać w alkoholu izopropylowym (IPA)/ketonie metylowo-izobutylowym (MIBK): 2/1 i przepłukać w IPA.
- Naniesienie filmu Ti (5 nm) / Au (80 nm) na podłoże za pomocą parownika z wiązką elektromagnetyczną.
- Po osadzeniu złota zdejmij dwuwarstwę kopolimeru, mocząc podłoże w acetonie przez 4 godziny.
- Sprawdź podłoże za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM), aby potwierdzić kształt i rozmiar nanostruktury, usuń pozostały chrom z podłoża za pomocą mokrego wytrawiania za pomocą wytrawiacza CR-7 przez 60 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie spłucz w DDW.
- Zaprojektuj odstępy między środkami macierzy wynoszące 33 μm, aby pozostawić miejsce na obrazowanie komórek między macierzami. Ułóż nanostruktury w układzie 20 x 20 dla każdej matrycy o rozstawie 300 nm za pomocą nagrywarki wiązki elektronicznej. Każdy chip zawiera 300 matryc o typowym wymiarze nanostruktury o wysokości 80±2,5 nm i średnicy 70±2,5 nm.
- Zbadaj podzbiór macierzy za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM) w celu sprawdzenia rozmiaru i jednorodności.
- Przymocuj pierścień nośny, zwykle silikonowy, z tyłu szkiełka nakrywkowego za pomocą żywicy epoksydowej utwardzanej promieniami UV.
2. Czyszczenie wiórów i zastosowanie samodzielnie zmontowanej warstwy
- Do czyszczenia i regeneracji wiórów popiół plazmowy o mocy 40 W w mieszaninie 300 mTorr 5% wodoru i 95% argonu przez 45 sekund po czyszczeniu komory przez 5 min w tych samych warunkach.
- Funkcjonalizować nanostruktury złota natychmiast po spopieleniu plazmowym poprzez zanurzenie chipa w dwuskładnikowym etanolowym roztworze tiolowym składającym się ze stosunku 3:1 SH-(CH2)8-EG 3-OH (SPO) i składnika z aminową lub karboksylową grupą funkcyjną, a mianowicie SH-(CH2)11-EG 3-NH 2 (SPN) lub SH-(CH2)11-EG 3-COOH (SPC).
- Pozostaw chip w roztworze tiolu O/N, aby utworzyć samoorganizującą się monowarstwę (SAM).
- Opłucz wiór etanolem i osusz go gazowym azotem.
- W razie potrzeby należy przechowywać sfunkcjonalizowany chip do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.
- Gdy składnik SPN lub SPC jest gotowy do użycia, należy reagować z ligandem, stosując skład chemiczny w zależności od wybranego liganda (patrz poniżej).
nuta: Chipy mogą być regenerowane i ponownie funkcjonalizowane dziesiątki razy. Dany chip może być używany przez okresy od 6 miesięcy do ponad roku. Widma mierzone na danej matrycy są niezawodnie odtwarzane po wielokrotnych regeneracjach przez spopielanie plazmowe, a następnie biofunkcjonalizacji.
3. Funkcjonalizacja powierzchni i charakterystyka kinetyczna
Uwaga: Użyj funkcjonalizowanego chipa w komercyjnym instrumencie SPR, aby scharakteryzować kinetyczne stałe szybkości między ligandem a analitem, a także zbadać odporność SAM na niespecyficzne wiązanie. Istnieje szeroki zakres natężeń przepływu i konstrukcji mikroprzepływowych, które pozwalają na wydajną funkcjonalizację powierzchni. Ponieważ dysponujemy dostępnym na rynku SPR, ustandaryzowaliśmy się wokół zalecanych natężeń przepływu. Zwracamy uwagę, że te natężenia przepływu są typowe dla wszystkich instrumentów SPR, a więc nie są restrykcyjne. Instrument SPR nie jest koniecznością, ponieważ cała funkcjonalizacja może być wykonana bezpośrednio na chipie do obrazowania zlokalizowanego rezonansu plazmonów powierzchniowych (LSPR), ale zmniejszył nasze obciążenie pracą, ponieważ jest to instrument multipleksowany, podczas gdy nasza konfiguracja mikroprzepływowa LSPR nie jest.
- Funkcjonalizuj komercyjny chip z gołego złota za pomocą SAM zgodnie z opisem w sekcji 2.
- W przypadku stosowania SAM na bazie SPC, aktywuj grupę karboksylową mieszaniną 1:1 133 mM 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC) i 33 mM N-hydroksysukcynimidu (NHS) w DDW przez 10 minut.
- Sprzęż aktywowaną grupę karboksylową z badanym przeciwciałem/ligandem przez 300 sekund przy natężeniu przepływu 30 μl/min. Zazwyczaj przygotuj ligandy w buforze fosforanowym o pH 6, ale może się to różnić w zależności od cząsteczki.
- Po koniugacji liganda przepływać 0,1 M etanoloaminy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) jako etap dezaktywatora przez 300 sekund z szybkością 30 μl/min. Etanoloamina pomaga w zminimalizowaniu niespecyficznego wiązania.
- Wprowadzić badany analit przy natężeniu przepływu 100 μl/min przy użyciu różnych stężeń i obliczyć stałe szybkości kinetycznej za pomocą oprogramowania do analizy kinetycznej.
- Jeśli niespecyficzne wiązanie jest problematyczne, zwiększ stosunek SPO do SPC lub SPN.
4. Ustawienia ogólne LSPR
- Ustawienia mikroskopu:
- Użyj lampy halogenowej o mocy 100 W, aby oświetlić próbkę firmy Koehler. Użyj filtra długoprzepustowego (zwykle odcięcia 593 nm) na ścieżce światła, aby wyeliminować długości fal, które nie przyczyniają się do przesunięcia rezonansu (ilustracja 1).
- Do zbierania danych LSPRi należy użyć mikroskopu odwróconego z obiektywem z 40-krotnym zanurzeniem w oleju (1,4 NA) i chłodzoną termoelektrycznie 16-bitową kamerą CCD.
- Umieść rozdzielacz wiązki w porcie wyjściowym mikroskopu, aby jednocześnie uzyskać obrazy i widma.
- Ustawić stolik mikroskopu z kontrolowaną temperaturą na 37 °C i równoważyć przez 4 godziny.
- Dołącz dodatkowy zestaw inkubacyjny do mikroskopu, aby regulować stężenie CO2 i wilgotność odpowiednio na poziomie 5% i 95%.
- Przygotowanie i montaż wiórów:
- Funkcjonalizować układ LSPR zgodnie z opisem w sekcji 2 z optymalnymi dwu-8-składnikowymi współczynnikami SAM określonymi na podstawie eksperymentów SPR.
- Załaduj chip do specjalnie wykonanego uchwytu mikroprzepływowego w następujący sposób. Umieść żeton na aluminiowym dnie. Umieść chip między tą dolną częścią a silikonową uszczelką i przezroczystą plastikową górną częścią. Użyj 4, aby clamp zespół.
- W przypadku typowej aplikacji tiolu na bazie SPC, nałóż kroplą 300 μl mieszaniny 1:1 133 mM EDC i 33 mM NHS w DDW, aby aktywować grupy karboksylowe składnika tiolowego SPC.
- Odczekaj 10 minut i ręcznie spłucz powierzchnię 10 mM PBS.
- Sprzęgnąć aktywowaną grupę karboksylową z ligandem (zwykle przeciwciałem lub fragmentem przeciwciała) będącym przedmiotem zainteresowania, pokrywając kroplami 300 μl roztworu liganda.
- Odczekaj 30 minut i ręcznie spłucz 10 mM PBS.
- Ułóż 300 μl 0,1 M etanoloaminy w PBS na chipie, aby zminimalizować niespecyficzne wiązanie. Odczekaj 10 min.
- Przemyć etanoloaminę PBS zawierającym 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
- Umieść kawałek kwarcu nad chipem, aby zmniejszyć wahania danych związanych ze zmieniającą się łąkotką.
- Utrzymuj chip w stanie mokrym za pomocą bufora PBS-T20 podczas montażu go na mikroskopie.
- Umieść zespół chipa LSPR w podgrzewanym stage sample holder i podłącz rurkę mikroprzepływową.
- Podłącz rurkę mikrofluidyczną do zestawu i bufora przepływowego (lub pożywki bez surowicy do badań komórkowych), aż do osiągnięcia stanu ustalonego.
- Pozwól, aby zespół i mikroskop osiągnęły równowagę przez co najmniej 2 godziny.
- Ustaw układ za pomocą joysticka tak, aby centralny układ był wyrównany ze światłowodem do spektroskopii. Dane spektroskopowe są pobierane za pomocą spektrometru i oprogramowania do analizy spektralnej.
- Utrzymuj ostrość matryc przez cały czas trwania eksperymentu, korzystając z programowego autofokusa, Zeiss Definite Focus lub równoważnego urządzenia z autofokusem.
5. Obrazowanie LSPR wydzielin anty-c-myc z komórek hybrydoma 9E10
Uwaga: Linia komórkowa hybrydoma użyta w tym badaniu wyraża przeciwciało anty-c-myc konstytutywnie i dlatego nie wymaga chemicznego wyzwalacza
- Funkcjonalizuj nanostruktury za pomocą peptydu c-myc. Ma to wartość KD wynoszącą 1,77 nM dla przeciwciał anty-c-myc wydzielanych przez klonowane komórki hybrydoma 9E10.
- Hodować komórki hybrydoma w kompletnej pożywce wzrostowej z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem w kolbie T75 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 . Utrzymuj gęstość komórek 4 ×105 komórek/ml.
- Do badań wydzielania komórek, komórki osadkowe z kolby T75 przez odwirowanie, przemyć dwukrotnie pożywką bezsurowicową RPMI-1640 (SFM) w celu usunięcia wydzielanych przeciwciał i dostosować gęstość komórek do 4 ×106 komórek/ml.
- Zbierz komórki i przetestuj ich żywotność przed wprowadzeniem ich do chipów LSPR.
- Wprowadzić 50 μl roztworu komórkowego ręcznie na chipy LSPR za pomocą mikropipety. Po kilku minutach od 25 do 50 komórek przylega do powierzchni chipów LSPR.
- Zmyj pozostałe komórki w roztworze świeżym SFM za pomocą systemu perfuzji mikroprzepływowej.
- Do obrazowania należy wybrać matryce LSPR, które znajdują się blisko, w granicach 10 μm, ale nie nakładają się na komórki.
- Aby upewnić się, że sygnał jest specyficzny dla wydzielanych przeciwciał anty-c-myc, należy wprowadzić pożywkę do hodowli komórkowej z obecnymi przeciwciałami i bez nich, jak również z przeciwciałami, ale z miejscami wiązania zablokowanymi przez obecność nasyconego stężenia peptydu c-myc w roztworze.
- Skalibrować czujniki na końcu każdego cyklu roztworem nasycającym przeciwciała anty-c-myc (250 nM). Pomaga to w normalizacji reakcji czujników i określaniu ułamkowego zajętości na podstawie profilu biofunkcjonalizacji każdego biegu.
- Skoryguj dryft w kierunku X i Y za pomocą oprogramowania do wyrównywania obrazu.
