Zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonowego w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki

Streszczenie

Źródło: Raghu, D. et al., Bezznacznikowa technika obrazowania czasoprzestrzennego wydzielin pojedynczych komórek. J. Vis. Exp.(2015)

Ten film pokazuje zlokalizowane obrazowanie powierzchniowego rezonansu plazmonów w celu wykrycia wydzielin białkowych z pojedynczej komórki. Wykorzystując układ mikroprzepływowy i plazmoniczny chip nanostrukturalny związany z peptydami, zmiany natężenia światła odbitego pod kątem rezonansu ujawniają interakcje z wydzielanymi białkami z pojedynczej komórki.

Protokół

1. Wytwarzanie nanostruktur

1. Jako podłoża do nanowytwarzania należy wybrać szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm i przybliżonej grubości 170 μm (nr 1,5).
2. Zanurz szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1) na co najmniej 6 godzin. Umyj szkiełko nakrywkowe nasączone piranią dużą ilością ultraczystej dejonizowanej wody destylowanej (DDW) o mocy 18,2 MΩ.
   ostrożność: Kwas piranii gwałtownie reaguje z materiałami organicznymi i należy się z nim obchodzić z najwyższą ostrożnością.
3. Osadzanie cienkiej warstwy chromu o długości fali 10 nm na szkiełkach n....

Wyniki

Rysunek 1.Konfiguracja optyczna.Oświetlone światło z lampy halogenowej jest najpierw filtrowane przez filtr długoprzepustowy (LP). Światło jest spolaryzowane liniowo (P1) i oświetla próbkę za pomocą obiektywu 40X/1,4 NA. Rozproszone światło jest zbierane przez obiektyw i przepuszczane przez skrzyżowany polaryzator (P2). Rozdzielacz wiązki 50/50 (BS) jest umieszczany w zebranej ścież.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 25 mm	Narzędzia biologiczne	Nr CSHP-1.5-25	Optymalna wartość to 170±5 μm
Polimetakrylan metylu	Mikrochemia	PMMA 950 A4
Metakrylan metylu mleczanu etylu	Mikrochemia	MMA EL6
Parownik wiązki elektronów	Temescal	FC-2000
Litografia wiązką elektronów	Raith (Raith)	Grupa 150
etanol	Sigma-Aldrich	459836
aceton	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 320110
Wytrawiacz chromowy CR-7	Cyantek	Silnik CR-7
Skaningowy mikroskop elektronowy	Zeiss	Ultra 55
Mikroskop sił atomowych	Veeco powiedział:	Nanoskop III
System spopielania plazmowego	Technika	Seria 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)	Prochimia	TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)	Prochimia	TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)	Prochimia	TH 002-m11.n3-0.2
System powierzchniowego rezonansu plazmonowego	Biorad	Kontroler XPR36
Żeton z gołego złota	Biorad	Układ scalony GLC	Plazma zapylona w celu usunięcia monowarstwy
1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimid	Thermo	Numer katalogowy: 22980
N-hydroksysukcynimid (NHS)	Thermo	Numer katalogowy: 24510
Pentyloamina-biotyna	Thermo	Numer katalogowy: 21345
Etanoloaminy	Sigma-Aldrich	E9508
Neutraawidyna	Thermo	31000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Thermo	Numer katalogowy: 28374
Animacja 20	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P2287
Mikroskop odwrócony	Zeiss	Obserwator Axio	Mikroskop jest wyposażony w obiektyw zanurzeniowy z olejkiem 40X; Inkubacja CO2 i wilgotności firmy Pecon GmbH
Kamera CCD	Hamamatsu	Orca R2	Chłodzony termoelektrycznie (16 bitów)
spektrometr	Optyka oceaniczna	QE65Pro
Pakiet Spectrasuite	Optyka oceaniczna	Wersja 1.4
peptyd c-myc HyNic Tag	Solulink	SP-E003 (SmPL)
Przeciwciało monoklonalne anty-C-MyC	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M4439
Linia komórkowa Hybridoma	Kontroler ATCC (Kontroler T	CRL-1729 (wersja cr)
Antybiotyk Roztwór przeciwgrzybiczy (100×)	Sigma-Aldrich	Ciągnik hamulcowy A5955
Pożywka wolna od surowicy RPMI 1640	Invitrogen	Numer katalogowy 11835-030
Surowica bydlęca płodu	Kontroler ATCC (Kontroler T	30-2020
Rodamina DHPE	Technologie życiowe	L-1392