Analiza związku antygenowego między wirusami przy użyciu testu mikroneutralizacji opartego na obrazie

Abstract

Źródło: Lin, Y., et al. Optymalizacja ilościowego testu mikroneutralizacji. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test mikroneutralizacji oparty na obrazowaniu do analizy relacji antygenowych między wirusami grypy A i B. Zapewnia ilościowy i wizualny sposób oceny skuteczności przeciwciał lub innych metod leczenia w zapobieganiu infekcji wirusowej.

Protocol

1. Miareczkowanie wirusa

UWAGA: W zależności od liczby wirusów i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową o następujących elastycznościach: (1) Rozcieńczenie wirusa może być ułożone wzdłuż rzędów lub kolumn (Rysunek 1). Każdy wirus powinien zajmować osobny wiersz/kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia wirusa jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia wirusa w lewym górnym rogu. (3) Nie ma ograniczeń co do liczby duplikatów.

1. Podzielić wystarczającą ilość komórek MDCK lub komórek MDCK-SIAT8 na płytki 96-dołkowe (200 μl/basenik). Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 2 lub 3 dni, aby osiągnąć konfluencję. Rozmnażaj komórki w DMEM uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FCS) i antybiotykami (100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny). Inkubować komórki SIAT w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i 1 mg/ml siarczanu G418.
   nuta: Współczynnik rozcieńczenia zależy od doświadczenia i użytej linii komórkowej. Monowarstwa komórkowa musi być zlewająca się (tj. bez ściany komórkowej lub widocznego konturu w przypadku komórek MDCK i ciasno upakowany układ w przypadku komórek MDCK-SIAT1) w momencie inokulacji wirusa. Przykłady rozcieńczeń opartych na subkulturze zlewających się kolb komórek MDCK lub MDCK-SIAT1 podano w Tabeli 1.
2. Przemyć komórki 3 razy 200 μl pożywki wzrostowej wirusa (VGM) na dołek. Sterylizuj wielościenną podkładkę płytkową z 70% EtOH przez 30 minut, a następnie wypłucz ją w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub VGM przed myciem.
3. Zassać VGM i natychmiast dodać 50 μl VGM do każdej studzienki.
4. Dodaj 900 μl VGM do każdej z 6 sterylnych probówek (lub mniej, w zależności od liczby testowanych wirusów i duplikatów). Odpipetować 100 μl wirusa do pierwszej probówki, dobrze wymieszać i seryjnie rozcieńczyć, zmieniając końcówki między każdym rozcieńczeniem. Powtórz te czynności dla każdego wirusa, który ma być stopniowo miareczkowany.
   nuta: To da rozcieńczenia wirusa od ^10-1 do ^10-6.
5. Dodać 50 μl każdego rozcieńczenia wirusa, zaczynając od najwyższego rozcieńczenia (1 x ^10-5 na rysunku 1), do zduplikowanych studzienek (kolumny 9 i 10 na rysunku 1) płytki 96-dołkowej.
6. Umieścić płytkę w temperaturze 37 °C na 2-3 godziny, aby wirus mógł zainfekować komórki.
   nuta: Konieczna jest 2-3-godzinna inkubacja, aby zapewnić, że wirusy w inokulum mają wystarczająco dużo czasu, aby dotrzeć do monowarstwy.
7. Przygotować nakładkę (10 ml/płytkę)
   nuta: Nakładka składa się z 5 ml 2x DMEM, trypsyny (2 μg/ml stężenie końcowe), 20 μl 1 mg/ml bulionu i 5 ml lintersów bawełnianych z celulozy (patrz Lista materiałów).
8. Usunąć inokulum.
9. Dodaj nakładkę (200 μl do każdego dołka). Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, BEZ ZAKŁÓCEŃ.
   nuta: Pączkowanie wirusa następuje po około 4 godzinach, dlatego ważne jest, aby po tym czasie nie naruszyć płytki.
10. Zassać nakładkę ze studzienek.
11. Dodaj lodowaty 4% paraformaldehyd do PBS A (200 μl/dołek). Umieść je w temperaturze 4 °C na 30 minut lub w temperaturze pokojowej na 20 minut.
    UWAGA: PBS A to sól fizjologiczna buforowana fosforanami o naturalnym pH zawierająca 10 g NaCl, 0,25 g KCl, 1,437 g Na₂HPO₄, 0,25 g KH₂PO₄ i 1 l wody destylowanej (patrz Lista materiałów).
    UWAGA: Paraformaldehyd jest szkodliwy w przypadku wdychania i może spowodować oparzenia w przypadku połknięcia. Istnieją również ograniczone dowody na działanie rakotwórcze i może powodować uczulenie po kontakcie ze skórą.
12. Odessać paraformaldehyd i dwukrotnie przemyć płytki PBS A (200 μl/dołek).
13. Przechowywać płytki w PBS A w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości lub kontynuować następujące czynności.
14. Dodać bufor permeabilizacyjny (100 μl/basenik). Pozostaw w temperaturze pokojowej na 30 minut.
15. Umyć płytkę dwukrotnie PBS A (200 μl/basenik).
16. Dodać 50 μl pierwszego przeciwciała, mysiego MAb przeciwko grypie typu A (1:1000 w buforze ELISA), na basenie. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (lub 4 °C przez noc), wstrząsając.
17. Przemyj go 3 razy w 100 μl buforu do płukania (0,05% Tween 80 w PBS A, v/v) na studzienkę. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut między praniami. Alternatywnie umyj go 3 razy bez inkubacji, używając 300 μl na studzienkę.
18. Dodać 50 μl drugiego przeciwciała, koniugatu koziego anty-mysiego IgG (H + L) HRP (1:1,000 w buforze ELISA) na studzienkę. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wstrząsając.
19. Umyj go 3 razy, jak opisano w kroku 1.17.
20. Dodać substrat (50 μl/studzienkę). Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut lub do momentu, gdy wyraźnie widoczny będzie rozwój niebieskiego koloru.
21. Aby zatrzymać reakcję, umyć płytkę dwukrotnie 200 μl wody destylowanej na studzienkę, inkubując w temperaturze pokojowej przez 2 -3 minuty między płukaniami.
22. Wysuszyć płytkę na powietrzu i przechowywać ją w ciemnym miejscu (np. zawinąć w folię aluminiową).

2. Neutralizacja wirusa

UWAGA: Oblicz liczbę płytek wymaganych do testu neutralizacji. Każda płytka może pomieścić jednego wirusa i kilka surowic odpornościowych.

UWAGA: W zależności od liczby surowic odpornościowych i liczby duplikatów, można ustawić płytkę studzienkową o następujących elastycznościach: (1) Rozcieńczenie surowicy może być ułożone wzdłuż rzędu lub kolumny (Rysunek 2). Każda surowica powinna zajmować osobny wiersz lub kolumnę. (2) Przyrost rozcieńczenia surowicy jest elastyczny, ale powinien zaczynać się od najwyższego stężenia surowicy w lewym górnym rogu płytki. (3) Liczba duplikatów równoważy liczbę surowic odpornościowych. Więcej duplikatów może pomóc w wygładzeniu eksperymentalnych wariantów. (4) Liczba VC i liczba duplikatów kontrolnych komórek (CC) są elastyczne, ale powinny być również umieszczone w oddzielnych wierszach lub kolumnach. Oczekuje się, że liczba duplikatów VC jest znacznie większa niż w przypadku surowic odpornościowych.

1. Przygotuj monowarstwę komórki, jak w krokach 1.1-1.3, 2 lub 3 dni wcześniej.
2. Dodaj 50 μl VGM do każdego dołka płytki.
3. Użyj kolumn 11 i 12 odpowiednio dla VC i CC. Dodać 50 μl podwielokrotności surowicy traktowanej enzymem niszczącym receptory (RDE) w stosunku 1:20 do pierwszego rzędu (A) kolumn 1-10,
   nuta: Dla każdej kombinacji wirusa i surowicy test przeprowadza się w dwóch egzemplarzach, tak więc jedna płytka może na przykład zawierać jednego wirusa testowanego przeciwko pięciu surowicom odpornościowym.
4. Przeprowadzić 2-krotne rozcieńczenia seryjne, przenosząc 50 μl z rzędu A do rzędu H (kolumny 1-10 na rysunku 2) i odrzucając 50 μl z rzędu H.
5. Dodać 50 μl rozcieńczalnika do każdego dołka kolumny CC (kolumna 12 na rysunku 2).
6. Dodać 50 μl wirusa do każdego dołka płytki, z wyjątkiem kolumny CC (kolumny 1-11, wiersze A-H na rysunku 2).
7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 godziny. Usunąć inokulum. Dodaj nakładkę (200 μl) do każdego dołka. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, W STANIE NIEZAKŁÓCONYM. Zamocuj i wybarwić płytki jak w przypadku miareczkowania wirusa (kroki 1.11-1.22).

3. Kwantyfikacja neutralizacji

1. Umieść płytkę studzienkową w obszarze skanowania skanera płaskiego, jak pokazano na rysunku 2a. Użyj limitu pozycji w kształcie litery L, aby zapewnić optymalną i powtarzalną lokalizację obrazowania.
   nuta: Możliwe jest zobrazowanie dwóch płytek dołkowych podczas jednego skanowania.
2. Zeskanuj płytę.
3. Uruchom oprogramowanie "Wellplate Reader", aby obliczyć wymagane miana wirusa (ryc. 3).
   1. Kliknij przycisk "Załaduj obraz", aby załadować obraz. Przesuń czerwony pasek w polu "Próg globalny", aby dostosować próg próbkowania. Kliknij przycisk "Aktualizuj", aby sprawdzić efekt.
   2. Zaznacz pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie". Kliknij przycisk "Pobieranie próbek", aby określić ilościowo ICP. Kliknij przycisk "Zapisz", aby zapisać wyniki próbkowania, gdy zostaniesz o to poproszony.
      nuta: Po zakończeniu procesu pobierania próbek, jeśli zaznaczone jest pole "Oblicz neutralizację/miareczkowanie", automatycznie pojawia się nowe okno o nazwie "Obliczanie neutralizacji i miareczkowania".
   3. Załaduj lub wprowadź mapę płyty wiertniczej. Wskaż próg (np. 50%) w polu "Neutralizacja: Odliczenie infekcji (%)".
   4. Wybierz "Proces neutralizacji", aby obliczyć miana. Sprawdź miana i kliknij przycisk "Zapisz i zamknij", aby zapisać wyniki neutralizacji.
      nuta: Neutralizację podaje się jako odwrotność największego rozcieńczenia surowicy z predefiniowaną redukcją ICP (taką jak 50% lub 80%) w stosunku do VC (średnia z kolumny 11 na rysunku 4). W reprezentatywnych wynikach zastosowano 50% redukcję ICP.

Results

Rysunek 1: Przykład konfiguracji płytki studzienkowej w eksperymencie miareczkowania wirusa. Wirusy testowe są przypisywane do osobnych wierszy (od A do H). Kolumny są przeznaczone do różnych rozcieńczeń wirusa (od 1 do 12). Dwie kolumny użyto jako duplikatów dla każdego rozcieńczenia wirusa. Podziałka = 10 mm.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mikrofon VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM + 5 ml wstrzykiwacz/paciorkowiec
PBS A			Nature pH Sól fizjologiczna buforowana fosforanami: NaCl 10 g, KCl 0,25 g, Na2HPO4 1,437 g, KH2PO4 0,25 g i Woda dwubarwna 1 l
Avicell (Avicell)	Fmc	RC-581F	2,4 g w 100 ml wody destylowanej rozpuszczonej przez mieszanie na mieszadle magnetycznym przez 1 godzinę. Sterylizować w autoklawie
2x DMEM	Gibco (firma Gibco)	21935-028
trypsyna	Sigma	Zobacz materiał T1426
Nakładka (10 ml/płytkę):			5 ml 2x DMEM, Trypsyna 2 μg/ml stężenie końcowe, Avicell 5 ml
Tryton X-100 e	Sigma	Zobacz materiał T8787	Bufor przepuszczalny: 0,2% w PBS A (v/v)
Animacja 80	Sigma	Zobacz materiał P5188	Bufor myjący: 0,05% Tween 80 w PBS A (v/v)
Surowica konia	PAA Labs Sp. z o.o	Zobacz materiał B15-021	Bufor ELISA: 10% w PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80
Mysz MAb przeciwko grypie typu A	Biorad	MCA 400	1. przeciwciało: 1:1,000 w buforze ELISA
Kozioł anty-mysi IgG (H+L) koniugat HRP	Biorad	Rozdział 172-1011	2. przeciwciało: 1:1,000 w buforze ELISA
Prawdziwy substrat peroksydazy Blu	KPL (Polskie Biuro	50-78-02	Podłoże: Prawdziwy błękit +0,03% H2O2 g (1:1,000 30% roztworu)
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowania z płaskim dnem	Costar	3596
8-kanałowa podkładka wielościenna i rozdzielacz	Sigma	Zobacz materiał M2656
Skaner płyt doskonałości	Firmy Epson	V750 Pro	Oprogramowanie do obrazowania można pobrać bezpłatnie ze strony http://www.epson.com/cgi-bin/ Store/support/supDetail.jsp? oid=66134&infoType=Downloads.
Środowisko operacyjne oprogramowania: LabVIEW	Narodowa Korporacja Instrumentów	Okno oparte na konstruktorze NI Vision	Wersja: LabVIEW2012 lub nowsza