1. Sadzenie i leczenie komórek
- Hodować przylegające komórki w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75cm2 w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, stosując pożywkę preferowaną dla danego typu komórki. Pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną prawie zlewającą się warstwę komórkową.
nuta: Użyj pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) dla LNCaP, HEK293, mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), komórek BJ, MCF-7 i RPE-1.
- Przemyć komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C, pH 7,4. Zastąp PBS 3 ml 0,25% (w/v) trypsyny-etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) i inkubuj kolbę w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż komórki odłączą się (2–5 min).
- Ponownie zawiesić oderwane komórki za pomocą pożywki hodowlanej o pojemności 7 ml zawierającej 10% FBS. Wymieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki, używając końcówki do pipety o pojemności 0,5–20 μl. Użyj tej samej końcówki pipety, aby natychmiast napełnić szkiełko komory liczącej i policzyć komórki w automatycznym liczniku komórek.
- Przygotować odpowiednie rozcieńczenie (patrz uwaga poniżej) zawiesiny komórek z kroku 1.1.2 przy użyciu pożywki zawierającej 10% FBS i zasiać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (powierzchnia ~3,8cm2) przy użyciu techniki aseptycznej. Pozwolić na wzrost w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek, np. 60–90% konfluencji podczas zbioru.
nuta: Odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórkowej, które zapewni pożądane zbieganie się komórek podczas zbioru, będzie się różnić w zależności od typu komórki, a także w zależności od czasu trwania i rodzaju zabiegów eksperymentalnych. W związku z tym musi to być empirycznie ocenione w każdym przypadku.
- W przypadku eksperymentów, które mają być zarówno poddane obróbce, jak i zebrane 2 dni po wysianiu, wysiewaj 2,5 x 105 komórek LNCaP, HEK293 lub MCF-7, 5 x 104 MEF, 4 x 105 BJ lub 1,5 x 105 komórek RPE-1 w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
- W przypadku komórek, które luźno przylegają, należy pokryć płytki rodzajem powłoki zalecanym dla danego typu ogniwa. W przypadku ogniw LNCaP (i HEK293) należy stosować płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL).
- W tym celu dodać 500 μl PDL w stężeniu 2,5 μg/ml w sterylnymH2Odo każdego dołka i inkubować płytki w sterylnym środowisku przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C). Wyjąć PDL za pomocą odsysania i krótko przemyć każdą studzienkę 1 ml sterylnego H2O.
nuta: Ogólnie rzecz biorąc, krok 1.2.1 jest wykonywany bez żadnych eksperymentalnych zabiegów. Jeśli jednak wykonujesz RNAi, wygodne może być rozpoczęcie odwrotnej transfekcji z wysiewem.
- Wykonaj zabiegi eksperymentalne w zduplikowanych lub potrójnych studzienkach na warunek.
- Na przykład, potraktuj komórki 50 nM inhibitora mTOR Torin1, który na ogół jest skutecznym induktorem sekwestracji autofagicznej, lub poddaj komórki ostremu głodowi surowicy i aminokwasów poprzez przemycie komórek 1 ml bezaminokwasowego roztworu soli Earle'a (EBSS), a następnie inkubuj komórki w 1 ml EBSS w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla (CO2) w temperaturze 37 °C.
- Pozostawić jeden zestaw studzienek niepoddanych działaniu substancji w celu określenia poziomów tła dehydrogenazy mleczanowej (LDH) ulegających osadzaniu.
- Dodać nasyconą ilość inhibitora posekwestracyjnego bafilomycyny A1 (Baf) w przypadku braku lub obecności eksperymentalnych zabiegów, 3-4 godziny przed pobraniem komórek. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniem CO2 w temperaturze 37 °C.
- Użyj 100 nM Baf dla ogniw LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 i RPE-1 oraz 10 nM Baf dla MEF.
- W przypadku zabiegów eksperymentalnych, które trwają tylko 3-4 godziny (jak te opisane w kroku 1.3.1), należy dodać Baf jednocześnie z zabiegami. W przypadku dłuższych zabiegów eksperymentalnych należy odczekać do 3-4 godzin przed zbiorem i dodać 2 μl 500-krotnie zagęszczonego bulionu Baf bezpośrednio do podłoża.
- Wymieszać przez mieszanie płytki natychmiast po dodaniu Baf. W tym momencie zaleca się również dodanie makroautofagicznych inhibitorów sekwestracji jako kontroli, np. 10 mM inhibitora kinazy panfosfoinozytolu 3 (PI3K) 3-metylodeniny (3MA) lub 10 μM selektywnego inhibitora PI3K klasy III SAR-405.
2. Pobieranie komórek i przygotowanie do elektrozakłócenia
- Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji odessać pożywkę z odsysaniem i dodać 200 μl roztworu do oddzielania komórek (wstępnie podgrzanego do 37 °C) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (zwykle około 5 minut).
nuta: Podczas gdy 0,25% (w/v) trypsyna-EDTA może być stosowana zamiast roztworu do odrywania komórek, ten ostatni zawiera DNazę, która pomaga zmniejszyć lepkość oderwanych komórek. Dopóki pożywka jest dokładnie odessana, nie jest konieczne mycie komórek przed dodaniem Trypsyny-EDTA lub roztworu do odrywania komórek.
- Dodać 500 μl PBS o temperaturze pokojowej (20-25 °C) o pH 7,4 i zawartości 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdego dołka i zawiesić pipetą do momentu, gdy nie będą widoczne grudki komórek. Natychmiast przenieść zawiesinę komórkową do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
nuta: O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kolejne kroki należy wykonywać na lodzie.
- Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Dokładnie odessać supernatant (z odsysaniem), aby pozostawić osady komórek tak suche, jak to możliwe.
- Dodać 400 μl 10% (w/v) sacharozy (w ultraczystymH2O) do każdej probówki.
3. Elektrozakłócenie błony plazmatycznej i separacja frakcji sedymentacyjnych i całkowitych komórek
- Ponownie zawiesić osad ogniwa za pomocą pipety, aby uzyskać zawiesinę zbliżoną do pojedynczej komórki, a następnie przenieść go do kuwety do elektroporacji o średnicy 4 mm.
nuta: Zazwyczaj wystarcza pipetowanie w górę i w dół ~10–15 razy przy użyciu końcówki do pipety o pojemności 100–1 000 μl.
- Umieść kuwetę w elektroporatorze fali rozpadu wykładniczego i wyładuj pojedynczy impuls elektryczny o napięciu 800 V, 25 μF i 400 Ω; te ustawienia wytwarzają impuls o czasie trwania ~8 ms.
- Za pomocą nowej końcówki pipety przenieś rozdrobniony czynnik komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 400 μl lodowatego roztworu sacharozy buforowanego fosforanem (100 mM monofosforanu sodu, 2 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM EDTA i 1,75% sacharozy, pH 7,5) i krótko wymieszaj pipetując.
- Opcjonalnie: Aby sprawdzić, czy elektrozakłócenie błony plazmatycznej jest skuteczne, zmieszaj 10 μl rozcieńczonego roztworu komórkowego z kroku 3.3 z 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Przenieść do komory liczącej i sprawdzić, czy procent komórek dodatnich błękitu trypanowego wynosi >99%.
- Pozostawić próbkę w komorze zliczającej na 30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C) i sprawdzić, czy procent komórek niebieskiego trypan-dodatniego pozostał >99%.
- Opcjonalnie: Aby sprawdzić, czy elektrozakłócenie nie było zbyt ostre, to znaczy nie zakłóciło organelli wewnątrzkomórkowych, wykonaj kroki 1.1–3.3, jak opisano powyżej, ale użyj większego materiału wyjściowego (studzienka z 6-dołkowej płytki z ~80% zlewającą się warstwą komórek) i użyj 150 μl 10% sacharozy w kroku 2.5 i 150 μl buforowanego fosforanem roztworu sacharozy bez DTT w kroku 3.3.
- Za pomocą pipety ostrożnie nałożyć 200 μl rozcieńczonego roztworu zaburzającego tworzenie komórek na wierzchu poduszki o gęstości 1,2 ml buforowanej fosforanem pożywki o gradinie gęstości 8% (w/v) (np. 8% nykodenzu, 50 mM fosforanu sodu, 2,2% sacharozy, 1 mM EDTA) w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Wirować przy 20 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce z funkcją trybu miękkiego (do łagodnego przyspieszania i zwalniania) i ostrożnie umieścić probówki na lodzie.
- Ostrożnie usuń 60 μl z ~200 μL górnej frakcji, uważając, aby nie pobrać żadnego roztworu pożywki o gradiencie gęstości, i przenieś do świeżej probówki do mikrowirówki.
nuta: Powinien on zawierać cytozol o wyjątkowej czystości, określany jako "sok komórkowy".
- Zbadaj czystość frakcji otrzymanej w powyższym kroku, wykonując analizy western blot białek zawartych w organellach, używając standardowych technik i żeli o gradiacji 4–20%.
- Wykonaj na przykład immunoblotting dla katepsyny B, cytochromu c i izomerazy dwusiarczku białka, aby sprawdzić, czy porażenie prądem w kroku 3.2 nie zakłóciło odpowiednio lizosomów, mitochondriów lub retikulum endoplazmatycznego, oraz immunoblot dla LDH, aby zweryfikować obecność białka cytozolowego w soku komórkowym.
- Równolegle należy przeprowadzić immunoblotting na ekstraktach białkowych wykonanych z roztworu całkowitego rozpadu komórek, aby potwierdzić, że zastosowane przeciwciała mogą wykryć białka zawarte w organellach, które są oceniane.
- Powtórzyć kroki 3.1–3.3 dla każdej próbki.
- Usunąć 550 μl z każdego rozcieńczonego roztworu rozbijającego komórki (otrzymanego w kroku 3.3) do 2 ml probówek wirówkowych zawierających 900 μl lodowatego buforu do resuspensji (50 mM monofosforanu sodu, 1 mM DTT, 1 mM EDTA i 5,9% sacharozy, pH 7,5) uzupełnionych 0,5% BSA i 0,01% Tween-20 i krótko wymieszać pipetując.
- Wirować przy 18 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w celu wytworzenia granulek zawierających "osadzony LDH". Dokładnie odessać supernatant (z odsysaniem), aby granulki pozostały jak najbardziej suche. Umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
- Przenieść 150 μl z każdego rozcieńczonego roztworu zaburzającego tworzenie komórek (otrzymanego w kroku 3.3) do nowych probówek i umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Użyj tych próbek, aby określić "całkowity poziom LDH" w komórkach.
nuta: W tym momencie eksperyment można wstrzymać na tak długo, jak jest to pożądane.
4. Ekstrakcja LDH i pomiar aktywności enzymatycznej LDH
- Próbki "osadzonego LDH" (z etapu 3.6) i "całkowitego LDH" (z etapu 3.7) rozmrozić na lodzie.
- Do próbek "całkowitego LDH" dodać 300 μl lodowatego buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 1,5% Triton X-405 (uzyskując końcowe stężenie Triton X-405 wynoszące 1%). Obracać próbki na wałku w chłodni (4–8 °C) przez 30 minut.
- Dodać 750 μl lodowatego buforu do sporządzania zawiesiny z 1% Triton X-405 do próbek "osadzonego LDH" i ponownie zawiesić granulki za pomocą pipety, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
- Odwirować próbki z etapów 4.2 i 4.3 przy 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C do osadzenia nierozpuszczonych szczątków komórkowych.
- Zmieszać 4 części zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/0,75 mM pirogronianu z jedną częścią zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/1,8 mM NADH, aby uzyskać roztwór roboczy, który jest stabilny przez co najmniej trzy tygodnie w temperaturze 4 °C.
- Zmieszać 3–30 μl supernatantów z kroku 4.4 z 200 μl roztworu roboczego z kroku 4.5.
- Określić ilość LDH, mierząc aktywność enzymatyczną LDH jako spadek absorbancji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (forma zredukowana) (NADH) przy 340 nm w temperaturze 37 °C w porównaniu z wzorcem o znanym stężeniu LDH. Pomiary absorbancji należy wykonywać do momentu, gdy reakcja zbliży się do zakończenia, tj. do momentu, gdy absorbancja przy 340 nm przestanie się zmieniać w czasie.
nuta: Jest to klasyczna biochemiczna metoda pomiaru aktywności LDH. Chociaż obecny protokół przeprowadza reakcję w temperaturze 37 °C, można ją również przeprowadzić w temperaturze pokojowej (20–25 °C), co jest zalecane w przypadku ręcznej spektrofotometrii. Obecny protokół wykorzystuje zrobotyzowany multianalizator, który w zautomatyzowany sposób miesza próbki z roztworem roboczym na 96-dołkowej płytce i mierzy absorbancję przy 340 nm w temperaturze 37 °C co 20 s przez 3 minuty. Następnie oprogramowanie przyrządu oblicza stężenie LDH, wyrażone w jednostkach (U)/L, porównując nachylenie pomiarów absorbancji w czasie w porównaniu ze standardową krzywą uzyskaną przez kalibrację z wzorcem znanego stężenia LDH. Liniowy zakres detekcji przy tym podejściu wynosi 30–1 500 U/L. Alternatywnie istnieje szeroka gama dostępnych na rynku zestawów do pomiaru LDH. Niektóre z nich opierają się na sprzężeniu reakcji enzymatycznej z wytwarzaniem produktów kolorymetrycznych lub fluorescencyjnych, umożliwiając detekcję innymi środkami niż spektrofotometria UV oraz z innymi liniowymi zakresami detekcji.
