Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Luhr, M. et al., Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i niezawodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. J. Vis. Exp. (2018)

Film demonstruje test do oceny masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Wykorzystuje elektroporację do uwalniania białek cytozolowych, w tym dehydrogenazy mleczanowej (LDH). Sekwestrowane LDH i całkowite komórkowe frakcje LDH są oznaczane w celu oceny sekwestracji LDH, dostarczając wglądu w ogólną aktywność sekwestracji masowej.

Protokół

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sadzenie i leczenie komórek

  1. Hodować przylegające komórki w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75cm2 w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, stosując pożywkę preferowaną dla danego typu komórki. Pozwól komórkom rosnąć, aż osiągną prawie zlewającą się warstwę komórkową.
    nuta: Użyj pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) dla LNCaP, HEK293, mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), komórek BJ, MCF-7 i RPE-1.
    1. Przemyć komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C, pH 7,4....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml i 2 ml Eppendorf211-2130 oraz 211-2120
Płytki 12-dołkowe sokół353043
Rozwiązanie do odłączania ogniw AccumaxInnowacyjne technologie komórkoweNumer katalogowy A7089Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C przez lata, a następnie w lodówce przez kilka miesięcy
Bafilomycyna A1Enzo powiedział:BML-CM110-0100Rozpuścić w DMSO
Komórki BJKontroler ATCC (Kontroler TCRL-2522Stosować przy przejściu <30
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Firma VWR422361V
Komora licząca BurkerFisher Naukowy139-658585
Szkiełka komory liczenia komórek hrabinyThermoFisher ScientficZobacz materiał C10228
Hrabina II Automatyczny licznik komórekThermoFisher ScientficAMQAX1000
Szkło nakrywkowe do studzienki liczącej BurkerFisher Naukowy139-658586
Criterion Tris-HCl Żel, 4–20%, 26-dołkowy, 15 μl, 13,3 x 8,7 cm (szer. x dł.) Bio-Rad3450034
Naziemna telewizjaSigma-AldrichD0632
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)Gibco (firma Gibco)24010-043Zawiera 0,1% glukozy
EdtaSigma-AldrichE7889
Kuweta do elektroporacji (4 mm)Bio-Rad1652088
Elektroporator fali rozpadu wykładniczegoAparatura BTX Harvard Kompatybilność elektromagnetyczna EMC 630
Surowica płodowa bydlęca (FBS)SigmaF752410% stężenie końcowe w podłożu RPMI 1640
Ogniwa HEK293Kontroler ATCC (Kontroler TCRL-1573
ImidazolSigma-AldrichNumer katalogowy: 56750Autoklaw z roztworem 65 mM i przechowuj w lodówce przez wiele miesięcy
inkubator; Inkubator CO2 z bezpośrednim ogrzewaniem Autoflow IRNuAire (Wyspa NuAire)NU-5510E
Odczynnik do transfekcji lipofekcyjnej RNAiMAXRybak termiczny13778150
Ogniwa LNCaPKontroler ATCC (Kontroler TCRL-1740Stosować przy przejściu <30
3-metylodenina (3MA)Sigma-AldrichZobacz materiał M9281Zapas 100 mM w RPMI w -20 °C. Podgrzewaj materiał do 65 °C przez 10 minut i używaj przy końcowym stężeniu 10 mM
Mikrowirówka przechowywana w lodówceBeckman Coulter Nauki Przyrodnicze368831
Mikrowirówka w lodówce z funkcją trybu miękkiegoEppendorf Eppendorf 5417R
MRT67307 chlorowodorek (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Hamuje aktywność kinazy ULK. Rozpuścić w DMSO.
Przyrząd MaxMat MultianalyzerDiagnostyka ErbaPL-II
Ogniwa MCF7Kontroler ATCC (Kontroler TZobacz materiał HTB-22
NadhMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzOsłona osi1002424
Opti-MEM Obniżona pożywka w surowicyRybak termiczny31985062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco (firma Gibco)20012-019
Końcówki do pipet: 3 (0,5-20 μl)Firma VWRTel. 732-2223Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (1-200 μl)Firma VWRNr kat. 732-2207 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (100-1000 μl)Firma VWRNr kat. 732-2355 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
PipetyRybak termiczny4701070Zestaw Finnpipette F2 GLP
Poli-D-lizynaSigma-AldrichZobacz materiał P6407-10X5MGPrzygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w sterylnym H2O. Roztwór ten jest stabilny w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 rok.
PirogronianMerck-Millipore1066190050
Ogniwa RPE-1 (hTERT RPE-1)Kontroler ATCC (Kontroler TCRL-4000
Silnik RPMI 1640Gibco (firma Gibco)21875-037
SAR-405ApexBio (ApexBioNr kat. A8883Hamuje kinazę fosfoinozytolu 3-klasy III (PIK3C3). Rozpuścić w DMSO.
Tłumik Wybierz kontrolę ujemną #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select siRNA ukierunkowane na ATG9 (siATG9A)ThermoFisher/AmbionZobacz materiał s35504
Silencer Select siRNA ukierunkowane na FIP200 (siFIP200)ThermoFisher/AmbionZobacz materiał s18995
Silencer Select siRNA ukierunkowane na ULK1 (siULK1)ThermoFisher/AmbionZobacz materiał S15964
Silencer Select siRNA ukierunkowane na ULK2 (siULK2)ThermoFisher/AmbionZobacz materiał S18705
Silencer Select siRNA ukierunkowane na GABARAP (siGABARAP)ThermoFisher/AmbionS22362
SiRNA ukierunkowane na GABARAPL1 Silencer Select (siGABARAPL1)ThermoFisher/AmbionS24333
Silencer Select siRNA ukierunkowane na GABARAPL2 (siGABARAPL2)ThermoFisher/AmbionS22387
Sodu fosforan jednozasadowy dwuwodny (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Sodu fosforan dwuzasadowy dwuwodny (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo (Język prolabo)Numer katalogowy 28014.291
sacharozaFirma VWRNumer katalogowy: 443816T10% końcowe stężenie w wodzie; przefiltrować przez filtr 0,45 μm i przechowywać w lodówce przez wiele miesięcy
Thapsigargin powiedział:Sigma-AldrichZobacz materiał T9033Hamuje pracę pompy Ca2+ HEART ER. Rozpuścić w DMSO.
Tryton X-405 Sigma-AldrichZobacz materiał X4051% końcowy
Bejca błękitu trypanowego 0,4%Sondy molekularneZobacz materiał T10282
Trypsyna-EDTA (0,25% w/v trypsyny)Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 25200-056
Tween-20 (Kanał Telewizyjny)Sigma-AldrichZobacz materiał P22870,01% wersja końcowa
powiedział: cyfrowa powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczenie dehydrogenazy mleczanowejmetoda elektroporacjianaliza sekwestracji LDHizolacja autofagosom wprotok wirowaniaekstrakcja Tritonem X 405enzymatyczne ilo ciowe oznaczenie LDHtraktowanie g od wk nutrientowhamowanie autofagii lizosomalnej

Powiązane artykuły