Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Streszczenie

Źródło: Schaaf, K., et al. Wysokoprzepustowy kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko pasażowanym przez makrofagi Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Protokół

1. Warunki hodowli białka zielonej fluorescencji wyrażającego M. tuberculosis mc²6206 (Mtb-GFP)

UWAGA: Szczep auksotrofów M. tuberculosis H37Rv mc²6206 (ΔpanCD, ΔleuCD) transformowany za pomocą plazmidu pMN437 eksprymującego gfp (zielone białko fluorescencyjne) jest używany w całym protokole. Możliwe jest zastąpienie szczepu Mtb-GFP szczepem typu dzikiego bez ekspresji GFP, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do szczepu dla badaczy. Jednak ekspresja gfp jest pożądana, aby umożliwić wizualne potwierdzenie fagocyt....

Wyniki

Rysunek 1: Układ tabliczek z lekiem. (A) Przykładowy wzór płytki prowokacyjnej użytej w kroku 4. Pozwala to na równoległe testowanie dwóch leków w trzech studzienkach w 8 zdefiniowanych stężeniach. Jako reprezentatywny eksperyment zastosowaliśmy ryfampicynę (RIF) i moksyfloksacynę (MOXI) zaczynającą się odpowiednio od 2 μM i 2,5 μM. (B) Dostępny jest również alterna.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
7H9	BD Difco	Numer katalogowy: 271310	Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta
Middlebrook OADC	BD Nauki biologiczne	212351
Tyloksapol	Sigma	Zobacz materiał T8761	Przygotować 20% roztwór podstawowy wH2O; wysterylizować filtr
Sól półwapniowa kwasu D-pantotenowego	Sigma	Zobacz materiał P5710	Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 24 mg/ml wH2O; sterylizować filtrem
L-leucyna	MP Biomedycyna	194694	Przygotować 50 mg/ml roztworu podstawowego wH2O; sterylizować filtrem
Higromycyna B	EMD Milipore	400051	Przygotować 200 mg/ml roztworu podstawowego wH2O
Nalgene Kwadratowa butelka na podłoże PETG	Rybak termiczny	2019-0030
Nośniki RPMI 1640	Klon	SH30027.01
Surowica bydlęca płodu	Atlanta Biologicals	S12450H
L-glutamina	Corning	MT25005CI
HEPESY	Klon	SH30237.01
Czytnik płytek Cytatation 3	Biotek		Możliwość współpracy z dowolnym czytnikiem płytek fluorescencyjnych i mikroskopem
Oprogramowanie Gen5	Biotek		Rejestracja i analiza konwersji rezasuriny
Ryfampicyna	Fisher Naukowy	BP2679250	Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego wH2O
Chlorowodorek moksyfloksacyny	Acros Organics	457960010	Przygotować 10 mg/ml roztworu podstawowego wH2O
Sól sodowa resazuryny	Sigma	Czynnik R7017	Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 800 μg/ml wH2O; sterylizować filtrem
Tween-80	Fisher Naukowy	T164500	Przygotować 20% roztwór podstawowy wH2O; wysterylizować filtr

powiedział: powiedział: TGL powiedział: