1. Warunki hodowli białka zielonej fluorescencji wyrażającego M. tuberculosis mc26206 (Mtb-GFP)
UWAGA: Szczep auksotrofów M. tuberculosis H37Rv mc26206 (ΔpanCD, ΔleuCD) transformowany za pomocą plazmidu pMN437 eksprymującego gfp (zielone białko fluorescencyjne) jest używany w całym protokole. Możliwe jest zastąpienie szczepu Mtb-GFP szczepem typu dzikiego bez ekspresji GFP, aby umożliwić łatwiejszy dostęp do szczepu dla badaczy. Jednak ekspresja gfp jest pożądana, aby umożliwić wizualne potwierdzenie fagocytozy i tworzenie agregatów Mtb/makrofagów. W celu długotrwałego przechowywania, Mtb-GFP zamrażano w temperaturze -80 °C w kompletnych pożywkach 7H9 (opisanych w kroku 1.1) uzupełnionych 20% glicerolem.
- Przygotować kompletną pożywkę Mtb-GFP (7H9-C), uzupełniając pożywkę 7H9 10% Middlebrook OADC (katalaza albuminy i dekstrozy), 0,02% tyloksapol, 24 μg/ml kwasu D-pantotenowego, 50 μg/ml L-leucyny i 50 μg/ml higromycyny B.
- Rozmrozić jedną fiolkę Mtb-GFP i dodać 10 ml 7H9-C do kolby PETG o pojemności 30 ml z kwadratowym dnem.
- Inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (50 obr./min). Wykonuj pomiary gęstości optycznej (OD600) co kilka dni, aż OD600 osiągnie 1.0 (około 5-8 dni).
- Rozcieńczyć i pasażować kulturę w razie potrzeby, aby utrzymać OD600 w zakresie 0,2-1,0.
- W przypadku infekcji należy użyć ustalonej hodowli Mtb-GFP w logarytmicznej fazie wzrostu (OD600 0,6-1). Aby uniknąć grudkowatych kultur, należy poddać sonikację kolby hodowlanej Mtb w łaźni wodnej (130 W; impulsy 3 x 5 s) raz lub dwa razy w tygodniu.
2. Warunki hodowli komórek THP-1
- Przygotuj kompletną pożywkę komórkową THP-1 (RPMI-C), uzupełniając pożywkę RPMI 1640 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą, 2 mM L-glutaminą i 10 mM kwasem HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy).
- Inkubować komórki w kolbie T-75 w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze 5% CO2 .
- Policz komórki za pomocą hemocytometru lub cytometrii przepływowej co drugi dzień i utrzymuj komórki THP-1 w gęstości od 0,1 do 0,6 miliona na ml.
3. Protokół infekcji do generowania struktur agregacji mtb/makrofagów
- Przygotowanie komórek THP-1 (na płytkę 96-dołkową)
- Odwirować 7 x 106 komórek THP-1 przy 250 x g przez 5 minut. Zawiesić w 7 ml RPMI-C.
- Przygotowanie do MTB-GFP
- Wirować 2,8 x 108 Mtb-GFP przy 3 200 x g przez 5 minut w wirówce z odchylanym kubełkiem, stosując konwersję OD600 1,0 = 3 x 108 bakterii/ml.
- Przemyć raz za pomocą RPMI-C i odwirować jak w kroku 3.2.1.
- Zawiesić ponownie w 7 ml RPMI-C i wirować przez 10 s.
- Zakażenie
UWAGA: Zobacz rysunek 1, aby zapoznać się z szablonem.
- Przygotować 96-dołkową płytkę, dodając 200 μl sterylnej wody w rzędach A i H oraz kolumnach 1 i 12 jako obwódkę wodną, aby zapobiec parowaniu pożywki.
- Dodaj 200 μl RPMI-C do kolumny 2 (od B2 do G2) dla kontrolki tła (puste).
- W celu zakażenia należy dodać zawiesinę Mtb-GFP (krok 3.2) do zawiesiny komórek THP-1 (krok 3.1) i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Ostateczna gęstość komórek THP-1 wynosi 5 x 105 na ml, a odpowiadająca jej wielokrotność infekcji wynosi 40.
- Wlać zawiesinę THP-1/Mtb-GFP do zbiornika o pojemności 25 ml.
- Dodać 200 μl zawiesiny THP-1/Mtb-GFP do wszystkich pozostałych 96 dołków (od B3 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej.
nuta: W przypadku pracy z wieloma płytkami 96-dołkowymi należy regularnie zawieszać pozostałą zawiesinę THP-1/Mtb w zbiorniku, aby zapewnić dodanie równomiernej mieszanki do każdej studzienki.
- Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 7-10 dni.
- Zmieniaj pożywkę co 2 dni, powoli usuwając 100 μl zużytej pożywki z górnej części każdej studzienki i delikatnie dodając 100 μl wstępnie podgrzanego RPMI-C za pomocą wielokanałowej pipety. Nie należy ponownie zawieszać studni i naruszać agregatów Mtb/makrofagów na dnie studni.
- Codziennie badaj wzrokowo studzienki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (obiektyw 4-10X), zwracając uwagę na wielkość agregatów Mtb / makrofagów. Do 7-10 dnia agregaty Mtb/makrofagów powinny być wystarczająco duże (patrz rysunek 2 w celach informacyjnych), aby można było przystąpić do badania skuteczności leku (sekcja 4).
- W razie potrzeby wykonaj zdjęcia 96 studzienek za pomocą zautomatyzowanego systemu obrazowania komórek wyposażonego w jasne pole i zestawy filtrów GFP, aby udokumentować tworzenie się agregatów Mtb/makrofagów.
nuta: Jeśli użytkownicy nie mają dostępu do zautomatyzowanego systemu obrazowania, obrazy reprezentatywnych studzienek można wykonać za pomocą dowolnego odpowiedniego mikroskopu z GFP i funkcją jasnego pola.
4. Test hamowania wzrostu w celu oceny skuteczności leku przeciwko Mtb pochodzącemu z agregatów Mtb/makrofagów
- Przygotowanie leku (warunki trzykrotne dla dwóch leków)
UWAGA: Zobacz rysunek 1A, aby zapoznać się z szablonem.
- Na oddzielnej płytce 96-dołkowej dodać 125 μl pożywki 7H9-C do B2 do G10.
- Przygotować dwa leki o podwójnym najwyższym pożądanym stężeniu końcowym w 1 ml 7H9-C, aby uwzględnić rozcieńczenie w kroku 4.2.4.
- Dodać 250 μl każdego leku do studzienek B11-C11-D11 i E11-F11-G11, odpowiednio w celu trzykrotnego leczenia.
- Za pomocą pipety wielokanałowej seryjnie rozcieńczyć badane leki dwukrotnie, przenosząc 125 μl z B11-G11 do B10-G10. Mieszać pipetując 5 razy na każdym etapie.
- Kontynuuj przesuwanie 125 μl od kolumny do kolumny (od prawej do lewej) po płytce i zatrzymaj się za kolumną 4.
- Po wymieszaniu kolumny 4 wyrzucić 125 μl do pojemnika na odpady. Kolumny 2 i 3 nie powinny zawierać żadnych leków, które mogłyby być stosowane jako tło (ślepa próba) i dodatnie kontrole wzrostu.
nuta: Alternatywnie postępuj zgodnie z szablonem na rysunku 1B, aby przetestować biblioteki leków. Każda 96-dołkowa płytka może pomieścić 58 leków w jednym stężeniu. Przygotuj tę płytkę leku, używając dwukrotnie pożądanego stężenia końcowego, ponieważ zostanie ona rozcieńczona na pół w kroku 4.2.4.
- Leczenie farmakologiczne:
- Pobrać 96-dołkową płytkę zawierającą makrofagi zakażone Mtb (agregaty Mtb/makrofagi).
- Ostrożnie zdekantować wszystkie odpowiednie studzienki (od B2 do G11) za pomocą pipety wielokanałowej. Wykonaj to w dwóch etapach: najpierw usuń 150 μl bez przechylania płytki, a następnie usuń pozostałą pożywkę (~50 μl), przechylając płytkę i wkładając końcówkę pipety do dolnej krawędzi studzienki. Ponieważ agregaty Mtb/makrofagów przylegają do dna studni, nie należy tracić żadnego materiału.
- Delikatnie dodać 100 μl pożywki 7H9-C do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki zawierającej agregaty Mtb/makrofagów.
- Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 100 μl z 96-dołkowej płytki zawierającej lek (krok 4.1) do odpowiednich dołków płytki infekcyjnej.
- Umieścić w szczelnie zamkniętej torbie i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.
5. Kwantyfikacja skuteczności leku za pomocą testu mikromiareczkowania resazuryny
- Przygotować roztwór podstawowy rezazuryny o końcowym stężeniu 0,8 mg/ml wH2O. Przefiltrować przez membranę z polifluorku winylidenu (PVDF) o wielkości porów 0,22 μm w celu sterylizacji.
- Przygotować roztwór roboczy rezazuryny, mieszając roztwór podstawowy rezazuryny,H2Oi Tween-80 (20% roztwór wH2O) w stosunku 2:1:1. Końcowe stężenia to 0,4 mg/ml rezazuryny i 5% Tween-80.
- Za pomocą czytnika płytek ustaw program do odczytu fluorescencji przy wzbudzeniu 530 nm i emisji 590 nm co 30 minut przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Wstępnie podgrzany czytnik płytek do 37 °C.
- Dodać 20 μl roztworu roboczego resazuryny do wszystkich odpowiednich studzienek (od B2 do G11) płytki poddanej działaniu leku (krok 4.11) za pomocą pipety wielokanałowej.
- Umieść tabliczkę na czytniku płytek i uruchom program skonfigurowany w kroku 5.3.
nuta: Aby ułatwić przetwarzanie dużych ilości płytek testowych, wystarczy rozwinąć test w inkubatorze o temperaturze 37 °C i wykonywać pojedyncze odczyty fluorescencji co 24 godziny. Dotyczy to również użytkowników, którzy nie mają dostępu do czytnika płytek z możliwością kinetyczną i inkubacyjną .
