1. Badania przesiewowe potencjalnych nanoinhibitorów TLR4 przy użyciu komórek reporterowych
UWAGA: Ponieważ sygnalizacja TLR4 wykorzystuje obie lądowe ścieżki zależne od TRIF zależne od MyD88, jest ona wybrana jako główny cel, aby objąć szeroki zakres ścieżek sygnałowych TLR. Komórki reporterowe THP-1-XBlue służą głównie do badania aktywacji NF-κB/AP-1, podczas gdy komórki THP-1-Dual służą do aktywacji IRF z transdukcji sygnału zależnej od TRIF.
- Określ optymalną dawkę LPS, generując krzywą dawka-odpowiedź przed badaniem przesiewowym.
- Rozcieńczyć roboczy roztwór LPS do końcowego stężenia 0,01 - 100 ng/ml w pożywce R10 (rozcieńczyć w skali log10). Ułóż wzór płytki i rozcieńcz ją na 96-dołkowej płytce do hodowli okrągłodennej. Upewnij się, że w każdym studzience znajduje się co najmniej 110 μl roztworu po rozcieńczeniu.
- Delikatnie usuń pożywkę hodowlaną z płytki wysiewanej komórkami za pomocą aspiratora próżniowego.
- Przenieść LPS zawierający pożywkę R10 przygotowaną na płytce rozcieńczającej (1.1.1) do płytki hodowlanej zgodnie z układem próbek. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C (w inkubatorze do hodowli komórkowych) przez 24 godziny.
- Po 24 godzinach ostrożnie przenieść supernatanty (80 μl/basenik) do nowej 96-dołkowej płytki okrągłodennej. Natychmiast przeprowadzić test luminescencji kolorymetrycznej i/lub lucyferazy na tych roztworach lub przechowywać je w temperaturze 4 °C (kilka godzin) lub -20 °C (dni) przed opracowaniem testu.
nuta: Projekt układu płyt powinien być prosty i przejrzysty do eksperymentów i analizy danych. Dla każdego warunku należy wziąć pod uwagę 2-4 powtórzenia. Zawsze dołączaj ujemną grupę kontrolną (LPS null). Zaleca się stosowanie komórek THP-1-XBlue do aktywacji NF-κB/AP-1, ponieważ komórki Dual mają stosunkowo wysokie tło aktywacji NF-κB/AP-1 po różnicowaniu w makrofagi. Możliwe jest jednak użycie ogniw Dual do zgłaszania zarówno aktywacji NF-κB/AP-1, jak i IRF.
- Opracuj test kolorymetryczny do aktywacji NF-κB/AP-1 i test luminescencji lucyferazy do aktywacji IRF.
- Aby ocenić aktywację NF-κB/AP-1, przenieś 20 μl supernatantu z każdej próbki do nowej 96-dołkowej płaskodennej płytki hodowlanej i dodaj 180 μl wstępnie ogrzanego roztworu substratu SEAP do każdej studzienki. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny, aby umożliwić rozwój koloru (od różowego do ciemnoniebieskiego). Zebrać absorpcję przy długości fali 655 nm na czytniku płytkowym.
ostrożność: Czas inkubacji można zmieniać w zależności od rozwoju koloru (30 minut do inkubacji przez noc). Zaleca się poczekać, aż gęstość optyczna (O.D.) najciemniejszego koloru osiągnie powyżej 1, unikając nasycenia rozwoju koloru (Od, >3).
- W celu analizy aktywacji IRF przenieść 10 μl supernatantu z każdej próbki do 96-dołkowej, przezroczystej, płaskodennej białej płytki. Dodać roztwór lucyferazy (50 μl) i natychmiast dobrze zebrać luminescencję do studzienki.
nuta: Zdecydowanie zaleca się korzystanie z czytnika płytek luminescencyjnych z funkcją automatycznego wstrzykiwania, aby zapewnić spójność odczytu luminescencji od studni do studni i od płytki do płytki. Jeśli roztwory substratów są wstrzykiwane ręcznie, należy zapewnić stały czas inkubacji i konfigurację odczytu dla każdej studzienki.
- Przeprowadź test przesiewowy na różnych hybrydach peptyd-GNP ze stymulacją LPS 10 ng / ml (na podstawie 1.1). Postępować zgodnie z tą samą procedurą opisaną w ppkt 1.2 dla opracowania testu reporterowego.
- Zagęścić hybrydy peptyd-GNP do 200 nM w pożywce R10 metodą wirowania. Odwirować 20 objętości roztworu hybrydowego (10 nM) przy 18 000 x g przez 30 minut i ostrożnie wyrzucić supernatanty. Zebrać hybrydy (na dnie probówki) do probówki, umyć je dwukrotnie PBS i ponownie zawiesić hybrydy w jednej objętości pożywki R10.
- Zmieszać równe objętości skoncentrowanych hybryd i LPS (20 ng/ml) zawierającego pożywkę R10, aby uzyskać końcowe stężenie hybryd i LPS wynoszące odpowiednio 100 nM i 10 ng/ml.
- Usunąć pożywkę hodowlaną z płytki hodowlanej i dodać 100 μl zmieszanego roztworu do każdej studzienki (3 kontrpróby dla każdego warunku); dołączyć kontrolę ujemną (tylko pożywka) i kontrolę LPS (10 ng/ml LPS bez hybryd).
- Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, przenieść pożywkę z każdej studzienki do probówki i odwirować probówki o stężeniu 18 000 x g, 4 °C przez 30 minut. Zebrać supernatanty (50-80 μl/probówkę) na 96-dołkową płytkę okrągłodenną i przeprowadzić próbę reporterową zgodnie z opisem w 3.2.
ostrożność: Wyrzucając supernatanty po odwirowaniu, nie mieszać mieszańców na dnie probówki.
nuta: Wirowanie w kroku 1.3.4 jest bardzo ważne dla usunięcia nieinternalizowanych hybryd nanocząstek z pożywki hodowlanej i może uniknąć interferencji hybryd z odczytami kolorymetrycznymi/luminescencyjnymi. Dzieje się tak, ponieważ nanocząstki złota mogą pochłaniać szerokie długości fal światła w zależności od ich wielkości i aglomeracji.
2. Walidacja hamującego działania potencjalnych kandydatów
UWAGA: Aby potwierdzić hamujący efekt potencjalnych kandydatów z badania przesiewowego, stosuje się dwa podejścia. Jednym z nich jest zbadanie reakcji na dawkę stymulantów (LPS) przy ustalonym stężeniu hybrydowym (lub na odwrót); drugim jest bezpośrednie przyjrzenie się hamowaniu sygnałów NF-κB/AP-1 i IRF3 poprzez immunoblotting.
- W podejściu pierwszym przeprowadzić test reporterowy ze 100 nM hybryd ołowiu i dwoma stężeniami LPS przy 1 ng/ml i 10 ng/ml zgodnie z tymi samymi procedurami, co w ppkt 1.3. Uwzględnij nieaktywną hybrydę (na podstawie wyników badań przesiewowych) jako kontrolę hybrydową dla porównania.
- W przypadku podejścia opartego na immunoblottingu należy postępować zgodnie ze standardowymi procedurami eksperymentalnymi.
- Hoduj komórki THP-1 w pożywce R10, zasiewaj komórki na 12-dołkowej płytce hodowlanej (2 x 106 komórek / dołek) i różnicuj je w makrofagi, traktując komórki 50 ng / ml PMA przez 24 godziny, a następnie odpoczywaj przez 2 dni.
- Po różnicowaniu komórek stymuluj komórki 10 ng/ml LPS z/bez hybryd (100 nM) w czasie (do 4 godzin). W różnych punktach czasowych (0, 5, 15, 30, 60, 120 i 240 min) przygotuj lizaty komórkowe do immunoblottingu. Uwzględnij nieaktywną hybrydę jako kontrolkę.
- Zbadaj sygnały IκBα, fosforylowanego p65 i fosforylowanego IRF3, aby zbadać hamujący wpływ hybryd ołowiu na aktywację NF-κB i IRF3. Sonduj sygnały β-aktyny i całkowitego IRF3 jako kontrole wewnętrzne.
nuta: Transdukcja sygnału często zachodzi znacznie szybciej (w ciągu kilku godzin) niż ekspresja enzymów reporterowych SEAP i lucyferazy (24 godziny). Zdecydowanie zaleca się również wykonanie testu żywotności badanych hybryd po 24 godzinach jako inną metodę walidacji.
3. Ocena specyfiki TLR
UWAGA: Aby zbadać specyficzność TLR hybrydy peptydu ołowiowego i GNP, testowane są inne szlaki sygnałowe TLR, w tym TLR2, TLR3 i TLR5. TLR7, 8 i 9 są wykluczone, ponieważ makrofagi pochodzące z THP-1 nie reagują dobrze na stymulację tych TLR z powodu braku ekspresji TLR7, 8 i 9 w makrofagach.
- Zbadać różne stężenia (od 1 ng / ml do 25 μg / ml) ligandów specyficznych dla TLR2 (Pam3CSK4), TLR3 (poli I:C) i TLR5 (wiciowca) na obu makrofagach pochodzących z komórek reporterowych, aby uzyskać optymalne stężenie, postępując zgodnie z tą samą procedurą w 1.1 i 1.2.
- Traktować komórki mieszaninami hybrydy ołowiowej (100 nM) i każdego liganda TLR w stężeniu otrzymanym z 3.1 w celu oceny swoistości hamującej hybrydy ołowiu zgodnie z procedurą doświadczalną opisaną w ppkt 1.3. Uwzględnij nieaktywną hybrydę jako kontrolkę dla porównania.
