Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja narządów
UWAGA: Wirus nie jest stabilny w temperaturze pokojowej (RT), więc liczba zwierząt zbieranych jednorazowo musi być starannie zaplanowana, aby zachować miano wirusa.
- Zakażone myszy przy użyciu wybranej dawki i trasy, w oparciu o wymagany fenotyp. W ramach tego protokołu należy zainfekować 8-10 tygodniowe myszy C57BL/6 z niedoborem receptora interferonu typu I (Ifnar1-/-).
- Znieczulenie myszy Ifnar1-/- koktajlem ketaminy (90 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg). Przetestuj odruch pedałowania przez mocne uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić znieczulenie. Podawać 1 x 105 jednostek tworzących ognisko (FFU) ZIKV w 50 μl podskórnie (SC) przez podnóżek.
- Przygotuj wszystkie materiały potrzebne do zbioru dzień wcześniej 2 nożyczki, kleszcze i 20 ml 70% etanolu (EtOH) w stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml do dezynfekcji narzędzi.
- Przygotuj strzykawki i igły: strzykawkę o pojemności 20 ml do perfuzji, igły 23 G (około 1 na klatkę) i strzykawkę o pojemności 1 ml z igłami 25 G (1 na 3-5 myszy). Przed ważeniem probówek dodaj stalowe koraliki (w kapturze) do 1,5 ml probówek z nakrętką O-ring (po jednej na każdy narząd). Probówki muszą być odpowiednie do homogenizacji.
- Przygotuj w dniu zbiorów materiały potrzebne do perfuzji i zamrożenia narządów.
- Napełnij wiaderko z lodem suchym lodem i 70% EtOH, aby zrobić kąpiel lodową. Przygotuj sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), zakładając, że potrzeba 25-30 ml PBS na mysz na każdą perfuzję, 5-10 ml na rdzeń kręgowy). Zaopatrz się w znieczulenie, koktajl ketaminy i ksylazyny i przyjmij 300 μl na mysz. Umieścić wszystkie materiały i wszelkie dodatkowe probówki wymagane do cytometrii przepływowej itp. w pojemniku wtórnym w celu przetransportowania do obiektu dla zwierząt.
- Przestrzegać wszystkich niezbędnych procedur przy wejściu, w tym zakładania i zdejmowania środków ochrony osobistej podczas wchodzenia i wychodzenia z obiektu dla zwierząt.
ostrożność: Wszystkie procedury należy przeprowadzić w certyfikowanym komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
- Podawać znieczulenie, 200-500 μL, dootrzewnowo w zależności od wielkości i wagi zwierzęcia. Jeśli pracujesz sam, podawaj znieczulenie jednemu zwierzęciu na raz, aby uniknąć zabicia zwierząt przed pobraniem narządów.
- Potwierdź dawkę znieczulenia, ściskając palec u nogi kleszczami, aby ocenić odruch pedałowania. Nie kontynuuj, chyba że całkowicie nie odpowiadasz. Użyj szpilek, aby przymocować mysz do tablicy woskowej. W tym momencie oblaj mysz 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia włosów podczas procedury pobierania narządów.
- Śmiertelne krwawienie przez nakłucie serca.
- Za pomocą nożyczek i kleszczy otwórz zwierzę przez klatkę piersiową, aby odsłonić serce. Zbieraj krew przez nakłucie serca (~ 800 μL), może to być używane do wielu testów, w tym chemii klinicznej, hematologii, cytometrii przepływowej w celu wykrycia odpowiedzi specyficznych dla antygenu oraz ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do analizy liczby kopii wirusa.
- W przypadku analizy wirusowego RNA metodą qRT-PCR należy pobrać krew do probówki EDTA w przypadku ekstrakcji z krwi pełnej lub w probówce mikrowirówkowej w przypadku ekstrakcji z surowicy. (W przypadku surowicy wiruj probówkę z maksymalną prędkością w wirówce o temperaturze pokojowej przez 20 minut i wyjmij surowicę do osobnej probówki). Po zakończeniu dodać liniowy poliakrylamid jako nośnik do próbki surowicy. RNA może być następnie analizowane lub przechowywane w temperaturze -80 °C w celu dalszego przetwarzania w późniejszym terminie.
- Napełnij strzykawkę o pojemności 20 ml PBS w temperaturze pokojowej (lub 37 °C) i przelej myszy, wkładając igłę motylkową do lewej komory. Przebij prawy przedsionek, aby umożliwić wydostanie się krwi i PBS. Powoli podawaj PBS, sprawdzając kolor wątroby, aby potwierdzić, że zwierzę jest całkowicie perfundowane. Wątroba powinna zmienić kolor z ciemnoczerwonego na różowy łososiowy.
- Jeśli przygotowujesz narządy do badania histologicznego, pozostaw igłę motyla na miejscu, a następnie przetapiaj 20 ml lodowatego 4% paraformaldehydu. Jeśli tak, wygodnie jest podłączyć strzykawkę do 3-drogowego kranu z podłączonymi do niego obiema strzykawkami, włączając i wyłączając zawór, gdy naprzemiennie przełącza się między PBS i PFA.
- Pobieraj organy do oznakowanych, zważonych probówek. W przypadku narządów obwodowych postępuj zgodnie z ustaloną kolejnością pobrania: wątroba, śledziona, nerki i płuca.
- Weź tylko jeden płat z wątroby, nie ma znaczenia, który, ale we wszystkich eksperymentach zawsze staraj się wziąć ten sam płat z kawałkiem tej samej wielkości. Podobnie w przypadku nerek i płuc należy wziąć tę samą nerkę i płuco. Jeśli cytometria przepływowa ma być również zakończona, każdy narząd może zostać przecięty na pół. Przechowuj połówkę, która ma być użyta do cytometrii, w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia zbiorów.
- Natychmiast po pobraniu umieść każdy narząd w oznakowanej probówce i umieść go w kąpieli suchego lodu. Miano wirusa zmniejsza się z czasem w temperaturze pokojowej, dlatego czas potrzebny na pobranie narządów jest niezwykle ważny. Myszy muszą być spójne, więc po bezpieczeństwie kolejnym priorytetem jest szybkość.
nuta: W przypadku pobierania narządów do mian wirusów, bardzo pomocne jest pobranie mózgu przez drugą osobę w tym momencie, aby zachować miana wirusa.
- Usuń pozostałe narządy z jamy ciała myszy, aby uzyskać dostęp do kręgosłupa i czaszki.
- Zdejmij mysz z planszy i usuń futro, a następnie usuń ręce i nogi.
Usuń głowę myszy za pomocą nożyczek do dekapitacji, lub chirurgicznych, aby pobrać mózg, przecinając czaszkę ząbkowanymi nożyczkami LaGrange przez otwór wielki. Następnie oderwij czaszkę kleszczami i zgarnij mózg szpatułką.
- Za pomocą mocnych, stępionych nożyczek usuń żebra i inne kości otaczające kręgosłup. Następnie przetnij kość miednicy, odsłaniając otwór kręgowy na poziomie lędźwiowym. W tym miejscu powinna być widoczna mała końcówka rdzenia kręgowego.
- Użyj strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej PBS i igły 18 G, aby wydalić rdzeń kręgowy poprzez "przepłukanie" rdzenia kręgowego od odcinka lędźwiowego do odcinka szyjnego kręgosłupa na szalce Petriego.
- Ostrożnie umieść ściętą końcówkę igły w otworze kręgowym, unikając nadmiernego nacisku, aby igła nie wtargnęła do trzonu kręgu. Przytrzymać mocno, aby wywrzeć nacisk na trzon kręgu i igłę, a następnie nacisnąć tłok strzykawki, aby usunąć pępowinę. Natychmiast przenieś rdzeń kręgowy do oznaczonej rurki i umieść ją w suchej kąpieli lodowej.
- Powtarzaj procedurę ze wszystkimi zwierzętami, aż do zakończenia zbiorów. Umieść narzędzia żniwne w 70% etanolu między zwierzętami. Postaw na spójność i szybkość. Odstęp czasu między poszczególnymi pobraniami narządów powinien być stały, aby nie zniekształcać wyników miana wirusa.
- Po zakończeniu należy zdezynfekować komorę bezpieczeństwa biologicznego i wszystkie materiały przed wyjęciem jej z pomieszczenia dla zwierząt.
- Wyjmij każdą probówkę z łaźni lodowej i zważ probówki, aby określić masę narządu. Aby określić wagę narządów, odejmij masę pustej probówki od masy rurki zawierającej narząd.
UWAGA: Na tym etapie narządy mogą zostać zamrożone w temperaturze -80 °C w celu dalszego przetwarzania w późniejszym terminie lub narządy mogą być homogenizowane bezpośrednio przed zamrożeniem poszczególnych podwielokrotności. Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie próbek zmniejsza miano wirusa. Dlatego ważne jest, aby wykonać tę samą procedurę dla wszystkich eksperymentów w ramach jednego projektu.
2. Homogenizacja narządów
- Przygotuj 3 znakowane probówki z zatrzaskami o pojemności 1,5 ml dla każdego narządu, który ma być homogenizowany.
- Jeżeli próbki nie są homogenizowane bezpośrednio po zbiorze, należy usunąć probówki z temperatury -80 °C. Próbki nie muszą być rozmrażane w celu homogenizacji.
- Umieść próbki na lodzie, aby były zimne, aby zminimalizować utratę miana wirusa. Następnie dodaj 1 ml zimnego DMEM zawierającego 5% FBS do każdej probówki zawierającej narządy.
- Natychmiast ubij rurki w ubijaku do koralików zgodnie z instrukcjami producenta. Homogenizuj wszystkie narządy za pomocą stalowych kulek w urządzeniu do homogenizowania kulek. Sprawdź, czy każdy narząd został całkowicie zhomogenizowany.
- Odwiruj szczątki narządów w mikrofudze o sile 12 000 x g przez 5 minut w mikrofugach schłodzonych do temperatury 8 °C. Następnie włóż rurki z powrotem do wiadra z lodem. W komorze bezpieczeństwa biologicznego porcjować próbki do probówek w celu przeprowadzenia niezbędnych testów. Następnie włóż rurki z powrotem do wiadra z lodem.
- Do testu tworzenia ostrości należy podać 500 μl do oznakowanej probówki. Następnie umieść rurki w stojaku na wiaderku na lód. Podwielokrotność 50 μl do probówki na RNA do fluorogenicznego ilościowego RT-PCR (qRT-PCR) w celu pomiaru liczby kopii genomu wirusa.
- Wyizolować całkowite RNA z narządów zakażonych zwierząt za pomocą dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA. Określ RNA wirusa flawiwirusa za pomocą zestawów starter-sonda specyficznych dla ZIKV, które rozpoznają unikalne sekwencje w każdym genomie flawiwirusa. Określ liczbę kopii wirusa za pomocą plazmidu kontrolnego zawierającego zdefiniowany dodatni jednoniciowy RNA wygenerowany in vitro przy użyciu polimerazy T7 zawierającej docelowe sekwencje ZIKV.
- Pozostałą próbkę, o objętości około 300 μl, przeznaczyć na porcję do trzeciej probówki i w razie potrzeby przechowywać w temperaturze -80 °C.
UWAGA: Jeśli próbki nie były wcześniej zamrożone, należy je zamrozić w temperaturze -80 °C. Jeśli próbki zostały wcześniej zamrożone, przed zatrzymaniem należy przejść do testu tworzenia ogniska i/lub izolacji RNA.
3. Test na obecność wirusa Zika
UWAGA: Ważne jest, aby uwzględnić kontrolę bez wirusa i kontrolę pozytywną. Kontrola pozytywna jest serią rozcieńczeń zapasu wirusa o znanym stężeniu. Nie wszystkie kontrole muszą znajdować się na tej samej płytce, ale gdy test staje się większy niż 5 płytek, należy dodać więcej kontroli i rozłożyć je na płytkach. Uważaj, aby nie zarysować monowarstwy ani końcówkami pipet, ani przez energiczne mycie. Miano wielu narządów może odbywać się tego samego dnia lub w różne dni. Jednak pojedynczy narząd nie powinien być mięsny przez wiele dni, ponieważ różne warunki testowe mogą wpływać na miano wirusa. Zdecydowanie zaleca się uruchomienie pojedynczego narządu w ciągu jednego dnia.
- Przed dniem przeprowadzenia testu należy przygotować komórki i odczynniki potrzebne do przeprowadzenia testu skupiającego.
- Przygotować pożywkę wzrostową zawierającą 500 ml DMEM z 5 ml HEPES i 25 ml FBS. Mieć komórki Vero-Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) rosnące w pożywce wzrostowej w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed rozpoczęciem testu. Komórki Vero nie powinny mieć wysokiego pasażu ani nigdy nie powinny rosnąć ponad 100% zbiegu przed rozpoczęciem testu.
- Przygotować 500 ml 2% roztworu metylocelulozy, autoklawizując w autoklawie szklaną butelkę o pojemności 1 l z 10 g metylocelulozy i dużym mieszadłem oraz oddzielną szklaną butelkę o pojemności 1 l z 500 mlH2O. Jeśli woda w autoklawie ostygła, podgrzej ją w kuchence mikrofalowej, aż butelka będzie gorąca w dotyku, ale nie wrząca.
- Delikatnie wlej ciepłą/gorącą wodę do butelki z metylocelulozą, będąc w kapturze do hodowli tkankowej. Częściowo zakręć butelkę i mieszaj na płycie grzejnej, aż metyloceluloza znajdzie się w roztworze (1-4 godziny). Podwielokrotność 2% roztworu metylocelulozy przelać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. 2% metylocelulozy można przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.
- Przygotować 5% roztwór paraformaldehydu w PBS do utrwalenia płytek i przechowywać go w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebny. Przygotować 1x bufor do płukania do prób formowania ostrości, dodając 0,05% Triton X-100 do PBS i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przygotować 1x bufor barwiący FFA, dodając 1 mg / ml saponiny do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu potrzeby. Można je przygotować z tygodniowym lub dwutygodniowym wyprzedzeniem.
- Obliczyć liczbę płaskodennych 96-dołkowych płytek potrzebnych do oznaczenia, tak aby każdy narząd był posiany w trzech egzemplarzach. Uwzględnij wystarczającą liczbę dodatkowych studzienek do kontroli dodatnich i ujemnych.
- Wyhoduj wystarczającą liczbę komórek Vero w pożywce wzrostowej, aby ukończyć zaprojektowany test. Trypsynizuj komórki Vero i policz je, zawieszając je ponownie w 1,5 x 105 komórek na ml w pożywce wzrostowej. Umieść komórki Vero w 96 dołkach z płaskim dnem w 3,0 x 104 komórkach Vero-WHO / studzience w pożywkach wzrostowych, dodając 200 μl na studzienkę.
- Inkubować płytki w temperaturze 37°C przy 5% CO2 przez noc, upewnić się, że płytki są wypoziomowane w inkubatorze, aby komórki były równomiernie rozmieszczone w studzience.
UWAGA: Każde laboratorium hoduje komórki Vero nieco inaczej; celem jest 90-95% zlewającej się monowarstwy w każdym studzience w dniu testu na obecność wirusa Zika.
- Rozcieńczyć próbki wirusa Zika w dniu testu. Jeżeli próbki narządów były wcześniej homogenizowane, wyjąć próbki z zamrażarki o temperaturze -80 °C i pozostawić do rozmrożenia przed umieszczeniem próbek na lodzie w celu przeprowadzenia testu.
- Na lodzie przygotuj okrągłodenną 96-dołkową płytkę, dodając 180 μl zimnej pożywki wzrostowej do rzędów od B do H, pozostawiając rząd A pusty. Dodać 150 μl każdej homogenizowanej próbki narządu do rzędu A okrągłej płytki dennej.
- Przygotować seryjne 10-krotne rozcieńczenia każdej próbki za pomocą pipety wielokanałowej. Rozcieńczyć próbki na okrągłodennej 96-dołkowej płytce, dodając 20 μl próbki do 180 μl pożywki wzrostowej, zmieniając końcówki pipet między każdym rozcieńczeniem.
- Przygotuj płytkę tworzącą ognisko, usuwając pożywkę z płaskiej płytki 96-dołkowej pokrywającej komórki Vero. Zrób to bezpośrednio przed dodaniem próbek wirusa, aby zapobiec wysychaniu monowarstwy.
- Dodać 100 μl rozcieńczenia wirusa do każdego dołka na płytce Vero. Dodaj próbkę, używając tego samego zestawu końcówek, przechodząc od najniższego do najwyższego stężenia. Płyty skalne na boki 2-4 razy, uważając, aby nie zawirować.
- Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1-2 godziny. Upewnij się, że płytki w inkubatorze są wypoziomowane. Podczas inkubacji rozgrzać 2% metylocelulozy do RT.
- Rozcieńczyć 2% roztwór metylocelulozy w pożywce wzrostowej. Rozcieńczenie powinno być w stosunku około 2:1 2% metylocelulozy do pożywki wzrostowej. Utrzymuj go w temperaturze pokojowej, aż nadejdzie czas, aby go użyć. Dodać 1-2 krople/dołek (ustawić pipetę na 125 μl) pożywki metylocelulozowej: pożywki wzrostowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
- Inkubować 32-40 h w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ponieważ komórki Vero każdego z nas rosną nieco inaczej, czynniki takie jak zbieganie się komórek i szczep wirusa Zika mogą zmienić czas inkubacji.
- Napraw komórki Vero za pomocą przygotowanego 5% roztworu paraformaldehydu.
- Dodaj 50 μl 5% paraformaldehydu do każdej studzienki na wierzchu warstwy metylocelulozy w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Utrwalanie można przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C, ale przykryj płytkę parafilmem, aby zmniejszyć parowanie.
- Zrzuć nakładkę i media z komórek do pojemnika na odpady wewnątrz szafy bezpieczeństwa biologicznego. Umyć delikatnie PBS, 150 μL/studzienkę. Usuń PBS z płytek i wyjmij płytkę z BSL-2.
- Powtórzyć płukanie PBS 2x, dodając 150 μL/studzienkę. Następnie wyjmij PBS. Dodaj 150 μl / studzienkę 1x bufor do płukania FFA i pozostaw na 5-10 minut w temperaturze pokojowej, aby przepuszczalność utrwalonych komórek.
- Wykryj infekcję za pomocą pierwotnego przeciwciała Zika. Przygotować przeciwciało pierwszorzędowe 4G2 (D1-4G2-4-15) o stężeniu 1 μg/ml w buforze barwiącym FFA. Przygotuj wystarczającą ilość przeciwciał dla całego testu.
nuta: Trzymaj się z dala od pieluch laboratoryjnych lub innych materiałów chłonnych o wysokiej zawartości kłaczków, ponieważ włókna będą miały negatywny wpływ na obrazowanie ognisk.
- Usuń bufor do płukania FFA z płytek. Dodać 50 μl/basenik pierwszorzędowego przeciwciała do buforu barwiącego FFA. Uszczelnić płytki parafilmem i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C na platformie kołyszącej. Test można przeprowadzić z inkubacją przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wizualizacja infekcji z dodatkiem drugorzędowego przeciwciała sprzężonego z HRP. Przygotować drugorzędowe przeciwciało anty-mysie znakowane HRP w stężeniu 1:5 000 w buforze barwiącym FFA. Przygotuj wystarczającą ilość przeciwciał do całego testu.
- Umyj komórki 3x buforem do mycia FFA, usuwając bufor do mycia, wrzucając go za każdym razem do zlewu. Wybarwić komórki przeciwciałem drugorzędowym w buforze barwiącym FFA w stężeniu 50 μl/basenik. Inkubować 1-2 godziny w temperaturze pokojowej.
- Umyj komórki 3x buforem do mycia FFA, usuwając bufor do mycia, wrzucając go za każdym razem do zlewu. Dodać 50 μl/studzienkę substratu Trueblue.
- Uważnie obserwuj płytki, czekając 2-15 minut, aż plamy będą w pełni zdefiniowane, a tło minimalne. Po wyświetleniu plam delikatnie umyj je wodą, chroniąc monowarstwę dłonią przed siłą płynącej wody. Osusz ręczniki papierowe (NIE PIELUCHY) i zobrazuj tak szybko, jak to możliwe.
- Spoty mogą być liczone ręcznie lub za pomocą automatycznego licznika spotów. W przypadku ręcznego liczenia można użyć lunety do analizy, aby pomóc w wizualizacji.
- Dla każdej próbki należy wybrać rozcieńczenie z łatwo rozróżniającymi ogniskami (np. 20 do 200 na dołek) i obliczyć miano w jednostkach tworzących ognisko na ml (FFU/ml), używając średniej z podwójnych dołków: FFU / ml = (średnia ogniska / studzienka) × (współczynnik rozcieńczenia) ÷ (ml inokulum).
