Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Pobieranie krwi i izolacja płytek krwi
- Pobrać ludzką krew od zdrowych, dorosłych dawców poprzez nakłucie żyły w dniu eksperymentu do 3,8% cytrynianu trójsodowego. Jedna probówka o pojemności 4,5 ml krwi wystarcza do uzyskania wystarczającej ilości osocza bogatopłytkowego (PRP) na 20-25 stanów u dawców, u których liczba płytek krwi jest bliska 250 x 103 na μl.
nuta: Unikaj pobierania krwi za pomocą igieł o wąskim przekroju (mniejszych niż 21 G).
- Przygotować PRP przez odwirowanie w temperaturze 22 °C i 140 x g przez 12 minut z długim hamulcem. Spowoduje to powstanie dwóch odrębnych warstw, z czerwonymi krwinkami na dole i jasnym PRP na górze.
- Wyizolować górną, mętną, żółtą warstwę PRP poprzez staranne pipetowanie przez końcówkę pipety przyciętą pod kątem 45° i uzyskać liczbę płytek krwi za pomocą pełnej morfologii krwi (CBC).
- W razie potrzeby przemyć płytki krwi w soli fizjologicznej z buforem soli sodowej 1,4-piperazynodietanolesulfonowej (PIPES) (150 mM chlorek sodu, NaCl, 20 mM PIPES) w obecności prostaglandyny E1 (PGE1) i ponownie zawiesić w buforze Tyrode'a (134 mM NaCl, 0,34 mM wodorofosforan di-sodu, Na2HPO4, 2,9 mM chlorek potasu, KCl, 1 mM chlorek magnezu, MgCl2, 5 mM glukozy, 12 mM wodorowęglan sodu, NaHCO3, 20 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy, HEPES, pH 7,35) z 5 mM glukozy, w przeciwnym razie przejdź do kroku 1.5. Poniższe kroki opisują pokrótce pranie.
- Dostosuj objętość PRP do 10 ml za pomocą soli fizjologicznej buforowanej przez PIPES i dodaj 0,6 μM PGE1.
- Wirować przez 8 minut przy 1 900 x g, następnie odrzucić supernatant i pozostawić osad płytek krwi w 400 μl roztworu Tyrode'a i glukozy na 5 minut.
- Delikatnie zawiesić osad płytek krwi i przechowywać go w spokoju przez 30 minut.
- Dostosować liczbę płytek krwi do ~250 x 103 płytki krwi na μl z zebranym ludzkim osoczem ubogim w płytki krwi (PPP) i utrzymywać zawiesinę w temperaturze 22 °C bez zakłóceń lub w warunkach delikatnej rotacji.
2. Przeciwciało i równomierne ścinanie
UWAGA: Wszystkie kroki w sekcji 2, które wymagają pipetowania, powinny być wykonywane powoli, aby nie wprowadzać żadnych ścinaczyń.
- Dodać pożądane przeciwciało do PRP lub przemytych płytek krwi i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół lub mieszając końcówką pipety. Pozostaw w spokoju w temperaturze pokojowej na 5-10 minut. Dodać równoważną objętość PPP lub buforu Tyrode'a do kontroli ujemnej.
- Włącz lepkościomierz stożkowy, ustaw temperaturę płytki na 22 °C i poczekaj, aż płytka osiągnie tę temperaturę.
- Odpipetować oczyszczone PRP lub umyte płytki krwi na lepkościomierz stożkowym z kontrolowaną temperaturą bezpośrednio na środku płytki. Upewnij się, że cała próbka jest osadzona między stożkiem a płytką w miejscu styku, a nie na zewnątrz krawędzi stożka.
- Ścinanie z odpowiednią szybkością i czasem trwania.
- Oblicz ścinanie zgodnie ze wskazaniami w instrukcji lepkościomierza lub jak pokazano wcześniej.
- Określ szybkość ścinania na podstawie lepkości i pożądanego naprężenia ścinającego za pomocą prawa lepkości Newtona;
; lepkość plazmy wynosi 1,5-1,6 centytypuaza (cP). Na przykład normalny zakres ścinania dla krążenia ludzkiego wynosi 5-30 dyn / cm2, a ścinanie powinno być stosowane w jednocyfrowej skali minutowej.
- Lekko oderwij stożek od płytki (~2 mm), tak aby próbka pozostała w kontakcie zarówno z płytką, jak i stożkiem, a następnie użyj końcówki do napełniania żelem lub innej długiej pipety, aby zebrać 5-10 μl ze środka objętości próbki.
- Inkubować ścięte próbki z żądanymi markerami przez 20 minut w temperaturze pokojowej. W przypadku markerów ekspozycji na fosfatydyloserynę, β-galaktozę i selektynę P należy użyć domeny C2 laktadheryny (LactC2) w stężeniu 0,08 μM, lektyny Erythrina cristagalli (ECL) w stężeniu 6,25 μg/ml i przeciwciała anty-P-selektyny (20 μg/ml).
- Utrwalić próbki w 2% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed rozcieńczeniem lub przechowywaniem w chłodni i przejść do kroku 3.1 lub przechowywać próbki w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 12 godzin.
3. Wykrywanie znaczników powierzchniowych i sieciowanie za pomocą cytometrii przepływowej
- Przeanalizuj próbkę za pomocą cytometrii przepływowej, zbierając co najmniej 20 000 zdarzeń dla każdego stanu.
- Określić ilościowo siłę sygnału markerów fluorescencyjnych, korzystając z wartości wysokości intensywności każdego fluoroforu lub średniej geometrycznej intensywności fluorescencji (MFI).
- Jeśli celem jest wykrycie sieciowania płytek krwi po obróbce ścinaniem, przeanalizuj próbkę na cytometrze przepływowym z możliwością obrazowania i określ ilościowo sieciowanie według parametrów obszaru i współczynnika kształtu.
- Narysuj histogram pola powierzchni i/lub współczynnika proporcji.
- Użyj kontroli ujemnej za pomocą albuminy surowicy bydlęcej (BSA) lub nośnika, aby narysować bramę wykluczającą większość w pełni okrągłych zdarzeń (ta bramka jest zwykle rysowana w proporcjach ~0,8) i określić ilościowo procent zdarzeń wewnątrz tej bramki. Zdarzenia o niższym współczynniku proporcji są bardziej podatne na wzajemne powiązania.
