Ocena potencjału przeciwdrobnoustrojowego mysich bakterii kałowych wytwarzających bakteriocynę

Streszczenie

Źródło: Bäuerl, C., et al. Metoda oceny wpływu bakteriocyny na mikrobiotę jelitową myszy. J. Vis. Exp. (2017).

Ten film pokazuje wykrywanie bakterii kwasu mlekowego wytwarzających bakteriocynę pochodzących z kału myszy. Test określa aktywność przeciwdrobnoustrojową bakteriocyny na określone szczepy bakterii.

Protokół

1. Liczenie LAB i aktywność bakteriocyny

1. Zważyć jedną osadkę kału z każdej próbki w probówce o pojemności 1,5 ml i dodać odpowiednią objętość lodowatego 0,9% NaCl, aby uzyskać 10% (w/v) roztwór. Użyj sterylnych mikrotłuczków do probówek o pojemności 1,5 ml do homogenizacji zawiesiny kałowej i przygotuj dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia w lodowatym 0,9% NaCl.
2. Policz całkowitą liczbę komórek LAB.
   1. Przenieść rozcieńczone komórki (100 μl) do 4 ml podgrzanego miękkiego agaru Man Rogosa Sharpe (MRS) (50 °C, 0,8% agaru). Wymieszaj przez wirowanie przed wylaniem komórek na stałą płytkę agarową MRS (1,5% agar).
   2. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze, a następnie inkubować komórki przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
3. Policz komórki produkujące bakteriocynę.
   1. Przenieść rozcieńczone komórki (100 μl) producenta bakteriocyny do 4 ml wstępnie podgrzanego miękkiego agaru MRS (50 °C, 0,8% agaru), wymieszać przez wirowanie i wylać komórki na płytkę agarową MRS (1,5% agar); warstwa ta jest określana jako pierwsza warstwa.
   2. Przenieś kolejne 4 ml bezkomórkowego miękkiego agaru MRS (0,8% agaru) na pierwszą warstwę, aby osadzić wszystkie komórki w miękkim agarze.
      nuta: Warstwa ta ma na celu zapobieganie wzrostowi komórek jako kolonii na powierzchni płytek agarowych. Komórki rosnące na powierzchni są łatwo przemieszczane podczas wylewania komórek wskaźnikowych na wierzch (krok 4.3.4) i dlatego komplikują interpretację wyników. Ta warstwa jest określana jako druga warstwa.
   3. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze, a następnie inkubować przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
   4. Aby zidentyfikować kolonie wytwarzające bakteriocynę, należy wymieszać 40 μl nocnej kultury odpowiedniego szczepu wskaźnikowego z 4 ml wstępnie podgrzanego miękkiego agaru. Wlej mieszaninę na talerz; Ta warstwa jest określana jako trzecia warstwa.
   5. Wysuszyć płytkę, zdejmując pokrywkę na 5 - 10 minut w sterylnym kapturze przed inkubacją przez 20 - 24 godziny w temperaturze 30 °C w celu wzrostu komórek i utworzenia kolonii.
      nuta: Kolonie wytwarzające bakteriocynę mają wyraźne (hamujące) strefy wokół kolonii (ryc. 1).

Wyniki

Rysunek 1: Wykrywanie produkcji bakteriocyny w LAB odzyskanym z kału za pomocą protokołu trójwarstwowego (zgodnie z opisem w procedurze)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plastikowa szalka Petriego	Thermo Scientific	Numer katalogowy 101VR20
Rosół z naparu mózgowo-sercowego	Conda	1400
Europejski agar bakteriologiczny	Pronadisa (Szczep Górski)	Rok 1800
Agaroza D1 Niskie EEO	Pronadisa (Szczep Górski)	Numer katalogowy 8010
1x bufor TAE	Thermo Scientific	15558042
Rosół MRS	Firma Difco	Numer katalogowy: 288130
Tabletki PBS	Sigma	P4417-100TAB
skala	METTLER TOLEDO	PB602-S

szt.