1. Poszycie BMM na szkiełkach nakrywkowych w celu zakażenia
- Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, umieszczając cztery (4) sterylne szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm (autoklawowane i przechowywane w zamkniętym szklanym pojemniku) na dnie każdej pustej studzienki.
nuta: Podnieś każde sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm za pomocą zasysającej końcówki zamontowanej na przewodzie próżniowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach bez zachodzenia na siebie, zwalniając je w żądanej pozycji, ściskając rurkę, aby przerwać próżnię.
- Odessać pożywkę (i wszelkie nieprzylegające komórki) z szalek Petriego pokrytych przylegającymi makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego i delikatnie przepłukać przylegające komórki 2x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez chlorku wapnia i magnezu (PBS -/-) wstępnie podgrzanym do 37 °C.
- Dodawać kroplami, 5 ml sterylnego 1x PBS -/- o końcowym stężeniu 1 mM EDTA do każdej szalki Petriego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia przylegających BMM. Sprawdzić, czy komórki są odłączone za pomocą mikroskopu.
- Zebrać wszystkie oderwane komórki zawieszone w 1x PBS -/- uzupełnionym 1 mM kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Opłucz każde naczynie 2x 5 ml PBS -/- i dodaj do puli z zawiesiną komórkową.
nuta: Zawiesinę komórkową można rozcieńczyć dodatkowym PBS -/- w celu ochrony makrofagów przed toksycznością EDTA podczas procesu pobierania.
- Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić makrofagi w pożywce o objętości 5-10 ml BMM przez pipetowanie. Umieść zawieszone komórki na lodzie, aby zapobiec przyczepianiu się do rurek i zbrylaniu.
- Policz żywe komórki, korzystając z wykluczenia błękitu trypanowego w hemocytometrze.
nuta: Aby policzyć komórki BMM zawieszone w pożywce o pojemności 5 ml, mieszanina rozcieńczeń 25 μl zawiesiny komórek w 445 μl PBS -/- i 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego zwykle umożliwia łatwe określenie ilościowe w hemocytometrze (biorąc pod uwagę 20-krotny współczynnik rozcieńczenia do końcowych obliczeń). Policz tylko komórki, które nie zostały wybarwione błękitem trypanowym (komórki żywotne). Objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie, jeśli mieszanina ta jest zbyt stężona lub rozcieńczona. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność BMM na preparat waha się od 2 x 107 do 5 x 107 komórek z jednej myszy.
- Przygotować zawiesinę komórek w pożywce BMM o pożądanym stężeniu galwanicznym (5 x 105/ml) i zdyspergować zawiesinę na 6 płytkach dołkowych w podłożu o pojemności 2 ml na studzienkę, tak aby każda studzienka otrzymała 1 x 106 makrofagów.
nuta: Jest to krytyczny krok, który zapewnia, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią liczbę makrofagów, aby równomiernie pokryć szkiełka nakrywkowe. Sprawdź, czy szkiełka nakrywkowe w studzienkach nie zachodzą na siebie ani nie unoszą się w podłożu. Jeśli tak, delikatnie wyreguluj za pomocą sterylnej końcówki do pipety.
- Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
2. Oczyszczanie zakaźnych form L. amazonensis
UWAGA: Przygotuj Leishmania na infekcje - oczyść metacykliczne promastigoty ze stacjonarnych kultur promastynów lub zróżnicuj promastigoty w kulturze do formy amastigoty przy użyciu standardowego protokołu różnicowania aksonicznego L. amazonensis.
- Oczyszczanie metacyklicznych promastigotów Leishmania za pomocą ośrodków o gradimencie gęstości (Materiały)
- Przygotować 40% roztwór podstawowy pożywek o gradiencie gęstości w sterylnej wodzie wolnej od endotoksyn.
- Rozcieńczyć roztwór gradientu gęstości w 10x pożywce M199 (bez surowicy), aby przygotować 10% stężenie w pożywce M199.
- Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr 0,22 μm.
nuta: Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności nie dłużej niż 1 miesiąc.
- Dodaj 2 ml roztworu pożywki o gradientzie gęstości 40% na dno stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Warstwę 2 ml roztworu pożywki gradientowej o gęstości 10% w M199 ostrożnie nałożyć na warstwę podłoża o gradiencie o gęstości 40%, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania się między dwiema warstwami.
- Zebrać 1 x 109 pasożytów z hodowli w fazie stacjonarnej przez odwirowanie przy 1 900 x g przez 10 minut.
- Zawieś komórki w 6 ml zmodyfikowanej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco.
- Warstwę 2 ml zawiesiny komórek bezpośrednio na warstwę pożywki o gradiencie gęstości 10%, delikatnie, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania między warstwami.
- Odwirowywać gradient przez 10 minut przy 1 300 x g w temperaturze pokojowej.
nuta: Ze względu na różnice we właściwościach fizycznych między gatunkami Leishmania, warunki wirowania dla każdego z nich mogą wymagać nieznacznego dostosowania, aby zapewnić maksymalną wydajność.
- Zbierz pasożyty (wzbogacone w metacykliczną formę promastygoty) z pasma utworzonego na górnej granicy ośrodków gradientu gęstości 10% (interfejs między warstwami ośrodków gradientu gęstości 0% i 10%).
- Rozcieńczyć pasożyty jedną objętością DMEM i zebrać przez odwirowanie (1 900 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).
- Ponownie zawiesić w pożywce DMEM o pojemności 500 μl i policzyć w hemocytometrze, aby określić ilościowo wydajność.
- Wytwarzanie L. amazonensis amastigotes w warunkach hodowli aksonicznej (niskie pH / podwyższona temperatura).
- Zmieszać 5 ml kultury promastigoty w fazie logarytmicznej (pH 7,4 w temperaturze 26 °C) z równą objętością pożywki amastigoty (pH 4,5), używając kolb o długości 25cm2 (łącznie 10 ml pożywki) i inkubować przez noc w temperaturze 26 °C.
- Przesunąć kolbę z 26 °C do 32 °C.
- Po 3 lub 4 dniach rozdzielić kulturę 1:5 w pożywce amastigote w temperaturze 32 °C.
- Sprawdź pasożyty w ciągu najbliższych 3 - 4 dni (maksymalnie 7 dni), aby zobaczyć, czy są gotowe do użycia w infekcjach.
nuta: Zdrowe amastigoty akseniczne powinny mieć owalny kształt, bez widocznych wici. Częściowo zróżnicowane amastigoty mają duży owalny kształt z krótkimi wiciami. Kultura nie powinna mieć wielu grudek - wiele grudek wskazuje na nierosnące, umierające pasożyty. Kulturę amastigoty można podzielić w stosunku 1:5 i utrzymywać przez maksymalnie 3 tygodnie.
3. Zakażenie L. amazonensis
- Rozcieńczyć zawiesiny pasożytów zgodnie z pożądanym MOI (zwykle 3-5 metacyklicznych promastigotów na makrofaga [MOI 1:3 lub 1:5] i 1 amastigota na makrofaga [MOI 1:1]). Dodać Leishmania w PBS -/- w objętości 50 - 100 μl do każdej studzienki zawierającej już 2 ml pożywki.
- Inkubować BMM przez 1 godzinę z amastigotami i 3 godziny z metacyklicznymi promastigotami w temperaturze 34 oC w celu zakażenia.
nuta: Optymalna temperatura infekcji może się różnić w zależności od gatunku.
- Po inkubacji dokładnie zmyć wolne pasożyty w każdym dołku 3x za pomocą 2 ml PBS -/- podgrzanego do 37 °C.
nuta: Delikatnie rozprowadź PBS, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie unoszą się jeden na drugim. Delikatnie zakręć płytką, a następnie odessaj płyn. Używaj oddzielnych końcówek zasysających, jeśli używasz wielu szczepów pasożytów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
- Ustalić 1 h lub 3 h punkty czasowe próbki, inkubując każdą studzienkę z 1,5 - 2 ml 2% PFA w PBS -/- przez 10 min. Przemyć 3x PBS -/-. Nie odsysać ostatniego mycia i przechowywać w lodówce płytki zawierające szkiełka nakrywkowe w PBS do czasu zabarwienia.
- Dodać 2 ml świeżej pożywki BMM do każdego dołka na płytkach w celu uzyskania dalszych punktów czasowych i inkubować w temperaturze 34 °C.
- Napraw pozostałe punkty czasowe zgodnie z potrzebami, jak opisano w kroku 4.3, i wstaw płytki do lodówki do czasu zabarwienia.
4. Barwienie DAPI i montaż szkiełek nakrywkowych
- Odessać PBS ze studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i dodać 1,5 ml PBS -/- z 0,1% niejonowym detergentem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3x przemyć 2 ml PBS -/-.
- Dodać 1 ml PBS -/- z 2 μg/ml 4′,6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) (rozcieńczonego z 5 mg/ml roztworu podstawowego w wodzie) do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
nuta: Czas inkubacji z DAPI ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej wizualizacji wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Jądra makrofagów barwią się szybko, ze względu na ich większy rozmiar i zawartość DNA, ale barwienie jąder pasożytów wewnątrzkomórkowych jest wolniejsze. Tak więc wydłużenie czasu inkubacji poza to, co jest wymagane do wizualizacji jąder BMM, jest konieczne, aby DAPI mogło przeniknąć przez błonę plazmatyczną pasożyta i błonę jądrową pasożyta. Przy prawidłowym barwieniu DAPI oprócz DNA jądrowego można również uwidocznić mitochondrialne DNA kinetoplastu w pobliżu kieszeni wiciowej pasożyta.
- Umyj każdą studzienkę zawierającą szkiełka nakrywkowe 3x 2 ml PBS -/-, a następnie podnieś i odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków, aby położyć komórkę do dołu i zamontować na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu.
nuta: Szkiełka nakrywkowe są niezwykle delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się. Unikaj wywierania na nie nacisku, zwłaszcza na ścianę boczną studni podczas podnoszenia. Dodanie kilku kropli PBS -/- zmniejsza napięcie powierzchniowe między szkiełkiem nakrywkowym a studzienką i ułatwia proces podnoszenia. Można użyć cienkiej igły, aby pomóc w podważeniu szkiełek nakrywkowych z dna studni. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku należy delikatnie docisnąć kleszkami, aby wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika montażowego. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostało złamane lub prawdopodobnie przewróciło się podczas procesu podnoszenia, nie montuj go ponownie; Wystarczy użyć zapasowego czwartego szkiełka nakrywkowego.
- Szkiełka należy przechowywać w lodówce do momentu oznaczania ilościowego.
5. Kwantyfikacja infekcji
- Zbadaj szkiełka zabarwione DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym, skupiając się na makrofagach za pomocą soczewki obiektywowej 100X z olejkiem immersyjnym (wzbudzenie przy 358 nm; optymalna emisja przy 461 nm).
Upewnij się, że fokus jest skupiony na warstwie makrofagów między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.
- Określ ilościowo liczbę makrofagów (dużych jąder barwionych DAPI) i liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego jądra makrofagów (patrz Rysunek 1A, DAPI) dla każdego pola widzenia, używając ręcznego licznika.
nuta: Nie wszystkie jądra Amastigotów mogą być widoczne w jednej płaszczyźnie ostrości ze względu na ich niewielkie rozmiary. Policz te, które są widoczne, gdy skupiasz się na jądrach makrofagów, a następnie użyj precyzyjnej ostrości, aby sprawdzić, czy w płaszczyznach powyżej i poniżej jąder makrofagów nie ma jąder pasożytów.
- Przejdź do innego pola widzenia, aby powtórzyć kwantyfikację. Użyj oddzielnego klucza licznika, aby śledzić liczbę zliczonych pól. Poruszaj się po polach widzenia w równoległych rzędach na każdym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec nakładaniu się liczenia.
- Określ ilościowo co najmniej 200 makrofagów na szkiełko nakrywkowe. Określić ilościowo każdy punkt czasowy infekcji w trzech egzemplarzach (3 szkiełka nakrywkowe). Policz czwarte szkiełko nakrywkowe, jeśli jedno z poprzednich nie nadaje się do liczenia z powodu nakładania się szkiełek nakrywkowych, złego montażu, stłuczenia szkła itp.
nuta: Jeśli nie można policzyć 200 makrofagów na jednym szkiełku nakrywkowym, policz zapasowe czwarte.
- Oblicz wskaźniki infekcji jako amastigoty/makrofagi lub amastigoty/100 makrofagów i określ procent zakażonych makrofagów na podstawie surowych danych ilościowych.
