$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie bakterii
UWAGA: Substraty bakteryjne całokomórkowe i oczyszczone peptydoglikany są używane jako substraty enzymatyczne zarówno w teście dyfuzji mikroszkiełkowej, jak i w teście uwalniania barwnika. Substraty te wymagają przygotowania przed przeprowadzeniem reakcji enzymatycznych. Poniższy protokół opisuje ich przygotowanie.
- Cały substrat komórek bakteryjnych
- Wytworzyć substrat komórek bakteryjnych, zaszczepiając 500 ml bulionu odżywczego 2 ml nocnej kultury Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Inkubować w temperaturze 30 °C z wytrząsaniem (125 obr./min) aż kultura osiągnie fazę wykładniczego wzrostu, zdefiniowaną jako faza szybkiego wzrostu prowadząca do podwojenia liczby bakterii. Do uprawy Salmonella enterica subsp. enterica (ATCC 10708) należy użyć bulionu odżywczego jako pożywki w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (125 obr./min).
- Uśmiercać termicznie każdą kulturę przez autoklawowanie przez 10 minut w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 3 atm.
- Zbierz zabity termicznie substrat bakteryjny przez wirowanie przez 20 minut przy 5,000 x g. Umyj granulkę trzykrotnie wodą typu 1 i ponownie zawiesić w minimalnej ilości wody. W tym badaniu zawiesić podłoża w 1,200 μl.
- Porcję 300 μl substratów komórek bakteryjnych rozprowadzić do 1,5 ml probówek do mikrofuge i przechowywać w temperaturze 20 °C.
2. Etykietowanie podłoża - Remazol Brilliant Blue R Dye Labeling
UWAGA: W teście uwalniania barwnika, substrat jest kowalencyjnie powiązany z barwnikiem R brylantowym Remazol. Poniższy protokół opisuje przygotowanie barwionych substratów enzymatycznych.
- Przygotować 250 mM roztwór wodorotlenku sodu (NaOH), rozpuszczając 1 g NaOH w 99 ml wody typu I, która ma być użyta do przygotowania 200 mM roztworu barwnika R (RBB) Remazol w kolorze błękitu brylantowego.
- Przygotować roztwór 200 mM RBB, rozpuszczając 1,25 g RBB w 98,75 ml ± 1 ml świeżego 250 mM roztworu NaOH.
- Ponownie zawiesić zabite termicznie komórki bakteryjne w stężeniu 0,5 g mokrej masy w 30 ml roztworu RBB. W przypadku oczyszczonego peptydoglikanu ponownie zawiesić peptydoglikan w stężeniu 0,3 g mokrej masy w 30 ml roztworu RBB.
- Mieszaninę reakcyjną inkubować w kolbie Erlenmeyera na platformie obrotowej przez 6 godzin w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając.
- Przenieść mieszaninę reakcyjną do inkubatora o temperaturze 4 °C i inkubować przez dodatkowe 12 godzin, delikatnie mieszając.
- Po inkubacji zebrać barwione podłoże przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 30 minut. Zdekantować roztwór barwnika z granulatu substratu.
- Usunąć niekowalencyjnie związany rozpuszczalny barwnik z substratów, wielokrotnie przemłukując znakowane barwnikiem komórki lub peptydoglikan (około 3-5 płukań) wodą typu I, a następnie odwirować. Przy każdym dodaniu wody dokładnie zawiesić pellet.
nuta: Po odwirowaniu rozpuszczalny barwnik nie jest już widoczny w płukaniu wodą. Podłoże należy poddać jeszcze jednemu płukaniu. Należy pamiętać, że podłoże pozostanie niebieskie, podczas gdy supernatant z ostatniego prania będzie przezroczysty.
- Barwione podłoża należy przechowywać zawieszone w minimalnej ilości wody w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania.
3. Ilościowy test uwalniania barwnika
UWAGA: Podczas testu uwalniania barwnika, hydroliza substratu barwionego RBB w reakcji enzymatycznej uwalnia barwione produkty do supernatantu reakcji. Kolorymetryczny pomiar ilości uwalnianego barwnika wskazuje na stopień aktywności enzymatycznej obecnej w próbce dla danego enzymu. Metoda ilościowa pozwala na porównanie różnych enzymów na różnych substratach i pozwala na zmianę warunków środowiskowych wpływających na reakcję enzymatyczną (np. temperatury, zasolenia i pH). Poniższy protokół opisuje przygotowanie i wykonanie testu uwalniania barwnika w celu ilościowego wykrywania aktywności enzymatycznej białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych.
- Przygotowanie do testu uwalniania barwnika
- Pozostawić zamrożony barwiony substrat do powrotu do temperatury pokojowej i dwukrotnie przemyć buforem testowym (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS), który jest empirycznie określony dla danego enzymu.
- Obliczyć objętość zawiesiny substratu, która jest potrzebna, mnożąc objętość reakcji wynoszącą 200 μl przez liczbę testów uwalniania barwnika, które należy przeprowadzić.
- Przygotować zawiesinę substratu, dodając barwiony substrat do objętości buforu do oznaczania, oznaczonej w ppkt 4.1.2, aż do uzyskania gęstości optycznej (OD) 2,0 przy długości fali 595 nm przy użyciu spektrofotometru. Aby pozostać w granicach funkcjonalnych spektrofotometru, zmierz 2,0 OD595 jako 1,0 dla rozcieńczenia stężonego roztworu w stosunku 1:1. Użyj buforu testowego jako pustego numeru.
nuta: Zmętnienie substratu w reakcji można podnieść powyżej 2,0, aby dopasować je do poziomów aktywności wysoce wydajnych enzymów.
- Zawiesić białkowy środek przeciwdrobnoustrojowy do oceny w buforze testowym o szacowanym stężeniu 1 mg/ml.
- Korzystając z testu mikropłytki zestawu do oznaczania białek z kwasem bicynchoninowym (BCA) zgodnie z protokołem producenta, określ rzeczywiste stężenie próbki białka, która ma być oznaczona. Dostosować stężenie zawiesiny podstawowej do 1 mg/ml przy użyciu buforu do oznaczania.
- Wykorzystanie testu uwalniania barwnika w celu określenia optymalnych warunków inkubacji białkowego środka przeciwdrobnoustrojowego
- Rozcieńczyć podstawową zawiesinę białkową przeciwdrobnoustrojową do 100 ng/μl. Stężenie to daje końcową masę reakcyjną wynoszącą 1 μg białka na objętość (10 μl) dodanego do reakcji testu.
- Określ zakres termiczny, który ma być oceniany dla białka bakteriolitycznego. Zakres termiczny w tych testach obejmował 5 °C, 15 °C, 25 °C, 35 °C, 45 °C, 55 °C i 65 °C.
- Przeprowadzić testy reakcji w probówkach do mikrofug o pojemności 0,5 ml. Dla każdego warunku termicznego dodać 10 μl białka podstawowego do 200 μl przygotowanej zawiesiny substratu.
- Inkubować w termocyklerze przez 8 godzin z mieszaniem przez inwersję raz na godzinę.
- Po inkubacji zatrzymać reakcje, dodając 25 μl etanolu.
- Usunąć niestrawiony, nierozpuszczalny substrat przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 2 minuty i przenieść 150 μl supernatantu reakcyjnego dla każdej mieszaniny reakcyjnej na 96-dołkową mikropłytkę płaskodenną, uważając, aby nie naruszyć osadu niestrawionego substratu.
- Zmierz aktywność enzymatyczną białka przeciwdrobnoustrojowego dla danego substratu, określając ilość rozpuszczalnego barwnika RBB zdysocjowanego z substratu po hydrolizie enzymatycznej. Aby określić ilościowo aktywność enzymatyczną, należy zmierzyć absorbancję supernatantu przy długości fali 595 nm za pomocą spektrofotometru z mikropłytkami. Zwiększona absorbancja przez rozpuszczalny barwnik uwalniany do supernatantu ze znakowanego substratu jest ilościowym pomiarem aktywności enzymatycznej.
nuta: Zmiana absorbancji jest reprezentowana przez jednostki aktywności (AU), gdzie 1 AU powoduje wzrost gęstości optycznej supernatantu reakcji uwalniania barwnika o 0,01 przy 595 nm. Ślepa próba, inkubowana ze wszystkimi składnikami reakcji z wyjątkiem enzymu, służy do odejmowania dowolnego barwnika, który jest uwalniany z substratu znakowanego RBB w wyniku inkubacji. Optymalna temperatura enzymatyczna zapewnia pomiar jednostki szczytowej aktywności.