Test uwalniania barwnika w celu ilościowego określenia aktywności enzymatycznej białek przeciwdrobnoustrojowych

Streszczenie

Źródło: Farris, M. H. et al., Jakościowe i ilościowe testy do wykrywania i charakteryzacji białkowych środków przeciwdrobnoustrojowych. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test uwalniania barwnika do ilościowego określania aktywności enzymatycznej białek przeciwdrobnoustrojowych. Białko przeciwdrobnoustrojowe degraduje znakowaną barwnikiem ścianę komórkową bakterii i uwalnia cząsteczki barwnika, zmieniając kolor roztworu na niebieski. Absorbancja roztworu koreluje z aktywnością enzymatyczną białka przeciwdrobnoustrojowego.

Protokół

1. Przygotowanie bakterii

UWAGA: Substraty bakteryjne całokomórkowe i oczyszczone peptydoglikany są używane jako substraty enzymatyczne zarówno w teście dyfuzji mikroszkiełkowej, jak i w teście uwalniania barwnika. Substraty te wymagają przygotowania przed przeprowadzeniem reakcji enzymatycznych. Poniższy protokół opisuje ich przygotowanie.

1. Cały substrat komórek bakteryjnych
   1. Wytworzyć substrat komórek bakteryjnych, zaszczepiając 500 ml bulionu odżywczego 2 ml nocnej kultury Bacillus subtilis 168 (American Type Culture Collection; ATCC 23857). Inkubować w temperaturze 30 °C z....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
48-dołkowa mikropłytka z płaskim dnem i pokrywką o niskim poziomie parowania	Becton Dickinson	Numer katalogowy: 3078
96-dołkowa mikropłytka z płaskim dnem (Costar 3595)	Corning, Inc.	3595
Agarozy	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP162-100
Bacillus subtilis 168	Kolekcja kultur typu amerykańskiego	Numer katalogowy: 23857
Termocykler dotykowy C1000	Bio-Rad
Norma równoważności McFarlanda (2,0)	Fisher Naukowy	Czynnik R20412
Bulion odżywczy	Fisher Naukowy	S25959B
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1×)	Teknova	Zobacz materiał P0200
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 23227
Spektrofotometr mikropłytkowy Synergy HT	BioTek Instruments, Inc.
Barwnik R brylantowy Remazol (RBB)	Sigma-Aldrich	Czynnik R8001
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Fisher Naukowy	S318-500
Woda destylowana UltraPure	Invitrogen	Numer katalogowy: 10977-015
rozwiązanie
Pożywka bulionowa
4 g odżywczego bulionu
500 ml wody typu I
250 mM roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)
1 g NaOH
99 ml wody typu I
200mM Remazol brylantowy niebieski barwnik R (RBB)
1,25 g RBB
98,75 ml 250 mM roztwór NaOH

powiedział: okrążeń