Test punktowy do oceny reakcji na stres oksydacyjny w szczepach bakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Ketelboeter, L. M. et al., Metody hamowania produkcji pyomelaniny przez bakterie i określania odpowiedniego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje test punktowy dostosowany do oceny reakcji szczepów bakteryjnych na stres oksydacyjny. Niektóre szczepy wytwarzają pyomelaninę, pigment przeciwutleniający. I odwrotnie, szczepy poddane działaniu czynnika testowego, prowadzące do zmniejszenia produkcji pyomelaniny, wykazują zwiększoną podatność na stres oksydacyjny, co skutkuje zmniejszoną żywotnością komórek w porównaniu ze szczepami wytwarzającymi pyomelaninę.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek hodowlanych, antybiotyków i 2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodionu (NTBC)

1. Przygotować bulion Luria-Bertani (LB) (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,25% chlorku sodu, NaCl w_H2O) i podwielokrotności do odpowiednich objętości. Sterylizuj w autoklawie. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
2. Przygotować 100 ml agaru LB (1% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 0,25% NaCl, 1,5% agaru w H₂O) w kolbach o pojemności 250 ml. Sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że agar jest stopiony przed przelaniem do talerzy.
   nuta: Kolby zawierające 100 ml agaru LB dadzą 4 płytki. Ilość agaru LB można zmienić, aby odpowiadała liczbie płytek potrzebnych do testu.
3. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM chlorku potasu, KCl, 10 mM wodorofosforan disodowy, Na₂HPO₄, 2 mM diwodorofosforan potasu, KH₂PO₄). Sterylizować w autoklawie lub filtracji i przechowywać w temperaturze pokojowej.
4. Przygotuj roztwory podstawowe antybiotyków dla gentamycyny, kanamycyny i tobramycyny.
   1. Przygotować odpowiednie stężenia antybiotyków dla szczepów Pseudomonas aeruginosa zawierających 100 mg/ml gentamycyny, 30 mg/ml kanamycyny i 10 mg/ml tobramycyny. Antybiotyki rozpuścić w wodzie, przefiltrować, wysterylizować (0,2 μm) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Zmieniać antybiotyki i ich stężenia w zależności od badanej bakterii.

2. Test punktowy płytki do odpowiedzi na stres oksydacyjny

1. Przygotuj nocne kultury szczepów, które mają być testowane. Dodaj 2 ml bulionu LB do probówek 16 x 150 mm (po jednej na szczep) i zaszczepij 1 izolowaną kolonią z każdego szczepu. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem na rotatorze do hodowli tkankowych w inkubatorze powietrznym.
2. Zmierz OD₆₀₀ kultur z nocy. Umyj kultury przed wykonaniem odczytów OD₆₀₀, aby wyeliminować pyomelaninę obecną w pożywce.
3. Umyć kultury przez odwirowanie 1 ml kultury w mikrowirówce o sile 16 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant i wszelkie luźno granulowane komórki za pomocą mikropipetora i ponownie zawiesić osad z komórkami stałymi w 1 ml LB.
4. Następnego dnia przygotuj płytki agarowe LB zawierające_H2O2jako stresor oksydacyjny. Dobrym punktem wyjścia jest zakres stężeń_H2O2od 0 do 1 mM.
   1. Stopić kolby agarowe LB. Schłodzić podłoże do temperatury około 50 °C w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać_H2O2bezpośrednio do schłodzonego podłoża w żądanych stężeniach. Zakręć kolbami do wymieszania. Patrz tabela 1 dla stężeń_H2O2i objętości stężonego_H2O2do dodania. Wartości te są oparte na 100 ml agaru LB.
   3. Wlać płytki natychmiast po dodaniu_H2O2i podpalić powierzchnię, aby usunąć pęcherzyki. Wydajność wynosi 4 płytki na 100 ml agaru LB. Oznaczyć płytki stężeniem _H2O2
   .
   4. Umieść płytki bez przykrycia w okapie przepływowym z wentylatorem pracującym przez 30 minut, aby usunąć nadmiar wilgoci z płyt.
      nuta: Talerze należy zużywać w tym samym dniu, w którym zostały przygotowane. Niezastosowanie się do tego może skutkować niespójnymi danymi.
      nuta: Stresory oksydacyjne, takie jak parakwat, można zastąpić_H2O2w tym teście. Stężenia stosowane dla innych stresorów oksydacyjnych mogą różnić się od stężeń stosowanych dla_H2O2.
5. Umyj i zmierz OD₆₀₀ kultur z nocy.
6. Znormalizować OD₆₀₀ wszystkich nocnych kultur do najniższej wartości dla badanego zestawu szczepów. P. aeruginosa na ogół ma OD₆₀₀ około 2,5, gdy jest uprawiana przez noc w LB.
   1. Określić objętość kultury potrzebną do rozcieńczenia kultury do najniższego OD₆₀₀ w całkowitej objętości 1 ml. Na przykład, jeśli kultura ma OD₆₀₀ równe 3, a najniższa OD₆₀₀ dla zestawu szczepów wynosi 2,5, wykonaj następujące obliczenia: (2,5) (1 ml) = (3) (x). x = 0,833 ml. 0,833 ml kultury zostanie umieszczone w probówce do mikrofuge.
   2. Oblicz ilość LB + DMSO potrzebną do doprowadzenia objętości kultury do 1 ml. W przykładzie w kroku 4.4.1 ilość LB + DMSO dodana do kultury wynosiłaby 0,167 ml (1 ml całkowita objętość – 0,833 ml kultury). Przygotować roztwory podstawowe LB + DMSO do użycia do tych rozcieńczeń w oparciu o objętość potrzebną do rozcieńczenia wszystkich szczepów.
   3. Wymieszaj kulturę i LB + DMSO przez wirowanie.
7. Aby utrzymać kultury w stałym stężeniu DMSO, należy wykonać dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia znormalizowanych kultur nocnych w PBS + DMSO.
   1. Przygotuj roztwór podstawowy PBS + DMSO. W przypadku jednego zestawu rozcieńczeń dla jednego szczepu należy zmieszać 300 μM objętości DMSO z PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 720 μl. Skaluj te zapasy w górę lub w dół w zależności od liczby testowanych szczepów.
   2. Oznacz probówki do mikrofuge dla ^10-1 do ^10-7 seryjnych rozcieńczeń. Dodać 90 μl PBS + DMSO do odpowiednich probówek. Używaj PBS + DMSO dla odmian uprawianych w LB + DMSO.
   3. Dodać 10 μl kultury do odpowiedniej probówki do rozcieńczania 10^:1. Wymieszać przez wirowanie i przenieść 10 μl rozcieńczenia ^10-1 do probówki z rozcieńczalaniem ^10-2. Powtarzać, aż wszystkie rozcieńczenia zostaną wykonane. Zmieniaj końcówki pipet między rozcieńczeniami.
8. Umieścić 5 μl rozcieńczeń od ^10-3 do ^10-7 na płytkach LB + H₂O_{2 dwukrotnie} dla każdego szczepu. Użyć jednej końcówki pipety, jeśli plamki są pokryte od najbardziej rozcieńczonego do najmniej rozcieńczonego (^10-7 do ^10-3). Nie przechylaj ani nie przechylaj płytki, dopóki płyn nie wyschnie w talerzu.
9. Inkubować płytki przez 24-48 godzin w temperaturze 37 °C (inkubator powietrzny), w zależności od szczepu.
   UWAGA: P. aeruginosa PAO1 będzie miał dobrej wielkości kolonie na LB po 24 godzinach inkubacji. Szczepy należy inkubować, aż uzyskają kolonie mniej więcej tej samej wielkości co PAO1.
10. Sfotografuj płyty za pomocą kamery CCD umieszczonej nad transluminatorem. Opcjonalnie edytuj zdjęcia pod kątem kontrastu i przytnij je do tego samego rozmiaru. Policz liczbę kolonii w każdym miejscu, aby określić zmiany wrażliwości na stres oksydacyjny.

Tabela 1: Stężenia_H2O2do dodania do agaru LB do testu na płytce punktowej stresu oksydacyjnego. Ta tabela podaje różne stężenia_H2O2 i odpowiadającą im ilość skoncentrowanego H₂O₂ do dodania do 100 ml agaru LB.

pkt. jest w stanie uzyskać informacje od 2,

Końcowe stężenieH2O2 (mM)	Ilość 9,79 M H2O2 (30% wag.) do dodania (μl)
0	0
0,2	Informacja o tym, że produkt leczniczy
0,4	Rozdział 4.09
0,6	6,13
0,8	Rozdział 8.17
1	Godzina 10.21

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Nazywany również nityzynonem. Rozpuszczalny w DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30% wag. w H2O. Stabilizowane.