Ocena skuteczności badanego związku przeciwko prątkom w bulionie

Streszczenie

Źródło: Zheng, X., et al. System do badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje test w bulionie w celu określenia skuteczności antybiotyku przeciwko Mycobacterium tuberculosis. Kultura bakteryjna jest inkubowana z różnymi stężeniami antybiotyku bakteriobójczego. Skuteczność bakteriobójczą mierzy się, oceniając obecność żywych bakterii za pomocą testu resazurynowego.

Protokół

1. Szczep bakteryjny i pożywka wzrostowa

1. Przygotować albuminę, dekstrozę i roztwór podstawowy soli (ADS), rozpuszczając 25 g albuminy surowicy bydlęcej, 10,0 g dekstrozy i 4,05 g chlorku sodu w 460 ml wody dejonizowanej. Wysterylizuj ADS z filtrem i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować bulion 7H9, dodając 4,7 g proszku 7H9 i 2 ml glicerolu do 900 ml oczyszczonej wody. Bulion 7H9 należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed kontynuowaniem. Przygotuj 7H9ADST, dodając 100 ml ADS i 0,5 ml Tween80 do 900 ml bulionu 7H9. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
3. Odważyć 50 mg siarczanu kanamycyny i rozpuścić go w 1 ml wody dejonizowanej; końcowe stężenie wynosi 50 mg/ml. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 0,5 ml roztworu podstawowego kanamycyny na 1 l 7H9ADST.
   nuta: To podłoże powinno być świeże, więc odpowiednio skaluj objętości w zależności od wielkości kultury.
4. Hoduj M. tuberculosis w 7H9ADST uzupełniony kanamycyną w kulturze stojącej. Codziennie wstrząsaj kulturą i rozcieńczaj ją, zanim OD₆₀₀ osiągnie 1,0, aby uniknąć zbrylania.
   nuta: Szczepem M. tuberculosis wykorzystanym do opracowania tej metody był H37Rv transformowany plazmidem pJAK2.A. pJAK2.A jest integracyjnym plazmidem opartym na wektorze pMV361, który umożliwia ekspresję wysokiego poziomu genu lucyferazy świetlika z promotora hsp60 i może być wybrany za pomocą kanamycyny.

2. Analiza aktywności w bulionie za pomocą testu resazuryny

1. Hodować M. tuberculosis w 7H9ADST do środkowej fazy logarytmicznej (~ 0,5 - 0,8 OD600). Rozcieńczyć kulturę za pomocą 7H9ADST do 0,01 OD₆₀₀. Rozcieńczyć związki w 7H9ADST do 2-krotności stężeń badanych i podsycić 100 μl każdego rozcieńczonego związku do każdego dołka.
2. Przenieść 100 μl rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 5 dni. Rozpuść 10 mg rezazuryny w 100 ml wody dejonizowanej i sterylnym filtrze.
3. Dodać 30 μl roztworu rezazuryny i monitorować zmianę koloru po 48 godzinach; wzrost bakterii jest wskazywany przez konwersję koloru z niebieskiego na różowy.
   nuta: Analizę ilościową można również przeprowadzić, mierząc fluorescencję przy 590 nm ze wzbudzeniem przy 530 - 560 nm lub absorbancję przy 570 nm i 600 nm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson i spółka	Numer katalogowy: 271210
Tween80	Fisher Naukowy	Zobacz materiał T164
Albumina o pH bydła7	Affymetrix	Numer katalogowy: 10857
Dekstroza	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP350
chlorek sodu	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP358
Siarczan kanamycyny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP906
Resazurin (Resazurin)	Alfa Aesar	Zobacz materiał B21187
glicerol	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP229
M. tuberculosis H37Rv
96-dołkowa biała płyta z płaskim dnem	Corning	Numer katalogowy: 3917
95-dołkowa przezroczysta płyta z płaskim dnem	Corning	3595
Przezroczysta zgrzewarka do płyt	Thermo Fisher Naukowy	AB-0580
Luminometr	Biosystemy stosowane	Tropix TR717

powiedział: powiedział: okrążeń powiedział: