$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Szczep bakteryjny i pożywka wzrostowa
- Przygotować albuminę, dekstrozę i roztwór podstawowy soli (ADS), rozpuszczając 25 g albuminy surowicy bydlęcej, 10,0 g dekstrozy i 4,05 g chlorku sodu w 460 ml wody dejonizowanej. Wysterylizuj ADS z filtrem i przechowuj go w temperaturze 4 °C.
- Przygotować bulion 7H9, dodając 4,7 g proszku 7H9 i 2 ml glicerolu do 900 ml oczyszczonej wody. Bulion 7H9 należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed kontynuowaniem. Przygotuj 7H9ADST, dodając 100 ml ADS i 0,5 ml Tween80 do 900 ml bulionu 7H9. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Odważyć 50 mg siarczanu kanamycyny i rozpuścić go w 1 ml wody dejonizowanej; końcowe stężenie wynosi 50 mg/ml. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 0,5 ml roztworu podstawowego kanamycyny na 1 l 7H9ADST.
nuta: To podłoże powinno być świeże, więc odpowiednio skaluj objętości w zależności od wielkości kultury.
- Hoduj M. tuberculosis w 7H9ADST uzupełniony kanamycyną w kulturze stojącej. Codziennie wstrząsaj kulturą i rozcieńczaj ją, zanim OD600 osiągnie 1,0, aby uniknąć zbrylania.
nuta: Szczepem M. tuberculosis wykorzystanym do opracowania tej metody był H37Rv transformowany plazmidem pJAK2.A. pJAK2.A jest integracyjnym plazmidem opartym na wektorze pMV361, który umożliwia ekspresję wysokiego poziomu genu lucyferazy świetlika z promotora hsp60 i może być wybrany za pomocą kanamycyny.
2. Analiza aktywności w bulionie za pomocą testu resazuryny
- Hodować M. tuberculosis w 7H9ADST do środkowej fazy logarytmicznej (~ 0,5 - 0,8 OD600). Rozcieńczyć kulturę za pomocą 7H9ADST do 0,01 OD600. Rozcieńczyć związki w 7H9ADST do 2-krotności stężeń badanych i podsycić 100 μl każdego rozcieńczonego związku do każdego dołka.
- Przenieść 100 μl rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 5 dni. Rozpuść 10 mg rezazuryny w 100 ml wody dejonizowanej i sterylnym filtrze.
- Dodać 30 μl roztworu rezazuryny i monitorować zmianę koloru po 48 godzinach; wzrost bakterii jest wskazywany przez konwersję koloru z niebieskiego na różowy.
nuta: Analizę ilościową można również przeprowadzić, mierząc fluorescencję przy 590 nm ze wzbudzeniem przy 530 - 560 nm lub absorbancję przy 570 nm i 600 nm.