Pomiar TEER w napromieniowanych promieniami rentgenowskimi komórkach nabłonka hodowanych jednocześnie z PBMC

Streszczenie

Źródło: Babini, G., et al. Metoda wspólnej hodowli do badania wzajemnych oddziaływań między napromieniowanymi promieniowaniem rentgenowskim komórkami Caco-2 a PBMC. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film pokazuje pomiar trans-nabłonkowego oporu elektrycznego w napromieniowanych komórkach Caco-2, zarówno w obecności jak i bez komórek PBMC. Metoda ta umożliwia badanie synergicznego wpływu promieniowania i komórek odpornościowych na barierę komórkową nabłonka.

Protokół

1. Przygotowanie do napromieniowania

Uwaga: Napromienianie komórek Caco-2 zostało przeprowadzone na oddziale radioterapii Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pawia, Włochy) za pomocą akceleratora liniowego rutynowo stosowanego w leczeniu różnych typów nowotworów.

1. Ustaw energię promieniowania rentgenowskiego fotonów na szczyt 6 MV. Akcelerator liniowy działa w trybie pulsacyjnym (czas między dwoma kolejnymi impulsami wynosi około 4 ms; czas trwania pojedynczego impulsu około 5 μs przy natężeniu dawki do 1 × ^10-3 Gy/p).
2. Umieścić 6-dołkowe płytki zawierające wkładki z Caco-2 na trajektorii promieni rentgenowskich na arkuszu pleksiglasu o grubości 1,4 cm (odpowiadającym odległości nieco większej niż nagromadzenie zużytego promieniowania) w odległości 100 cm od źródła promieniowania.
3. Umieść bolus o grubości 0,5 cm na każdej próbce przed napromienianiem, aby zagwarantować równowagę składowej promieniowania wstecznie rozproszonego i naładowanych cząstek.
4. Napromieniować komórki (dawki w zakresie 2 - 10 Gy) płaskim i symetrycznym (± 2%) polem promieniowania 20 x 20_cm2 i szybkością dawki 3 Gy/min.
   nuta: Kontrolne komórki napromieniane "pozorowane" poddano takim samym warunkom proceduralnym jak komórki napromieniane, bez wchodzenia do pomieszczenia napromieniania (otrzymana dawka: 0 Gy).
   ostrożność: Urządzenia wytwarzające promieniowanie jonizujące mogą być używane wyłącznie przez wyspecjalizowany personel.

2. Przeznabłonkowy opór elektryczny (TEER)

1. Nasiona 5 × 10⁵ komórek Caco-2 na tydzień przed napromienianiem w 6-dołkowych wkładkach do współhodowli (politereftalan etylenu (PET), 2 x 10⁶ porów/cm2).
2. Na 1 godzinę przed naświetlaniem zmierzyć TEER woltomierzem/omomierzem.
3. Napromienić komórki zgodnie z opisem w krokach 1.1 - 1.4.
4. Inkubować komórki Caco-2 w obecności/braku kokultury z PBMC w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO_{2 .}
5. Przez pierwsze kilka godzin po napromieniowaniu należy mierzyć TEER co godzinę, a następnie co 3 godziny do 48 godzin.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wkładki do hodowli komórkowych ThinCert 6-dołkowych do płytek wielodołkowych	Greiner Bio-one	Numer katalogowy: 657610	sprzęt
Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 6-dołkowa	Greiner Bio-one	Numer katalogowy: 657160	plastyczny
Płytka wielodołkowa do hodowli komórkowych, 24-dołkowa	Greiner Bio-one	Numer katalogowy: 662160	plastyczny
RPMI 1640 bez L-glutaminy	Lonza	12-167F	Odczynniki
Woltomierz/omomierz Millicell-ERS	Milipory	MERS 00001	sprzęt

powiedział: