Test biofilmu na płytce kołkowej do badań przesiewowych środków przeciwbakteryjnych

Streszczenie

Źródło: Dalecki, A. G., et al. Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Lek-susceptibility Asceptibility. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film demonstruje test do badania przesiewowego związków przeciwdrobnoustrojowych, które skutecznie eliminują biofilmy za pomocą płytki kołkowej. Metodologia ta monitoruje stan metaboliczny biofilmu po poddaniu działaniu związków przeciwdrobnoustrojowych, ułatwiając określenie minimalnego stężenia eradykacji biofilmu.

Protokół

1. Inicjacja biofilmu

1. Hoduj kulturę organizmów wytwarzających biofilm w pożywce bogatej w składniki odżywcze. Zaszczepić szczep Staphylococcus aureus Newman w 10 ml pożywki Muellera-Hintona z bulionu glicerynowego. Wszystkie prace związane z obchodzeniem się z S. aureus należy wykonywać w rękawicach i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C na wytrząsarce obrotowej (100-200 obr./min).
3. Oznacz OD₆₀₀ kultury za pomocą spektrofotometru i standardowej kuwety (długość ścieżki: 1 cm).
4. Obliczyć objętość (V) kultury potrzebną do przygotowania 20 ml inokulum o OD_{600 (inokulum)} 0,1 w pożywce Roswell Park Memorial Institute (CRPMI) przy użyciu wzoru: [V = 20 ml * 0,1/OD_{600 (kultura)}].
   1. Dodać obliczoną objętość kultury (od góry) do probówki wirówkowej i komórek osadu, wirując przez 1 minutę przy 10 000 x g. Aby przygotować inokulum biofilmu, należy odessać zużytą pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml CRPMI.
5. Wlać inokulum do zbiornika o pojemności 25 ml.
6. Ostrożnie zdejmij pokrywkę ze sterylnej 96-dołkowej płytki kołkowej, pociągając ją prosto do góry.
   Uwaga: Należy uważać, aby nie zanieczyścić kołków zwisających z pokrywy. Pokrywę można położyć do góry nogami na czystej powierzchni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
7. Używając pipety wielokanałowej o pojemności 200 μl, dodaj 125 μl inokulum do każdej studzienki w rzędach od A do G dolnej płytki.
8. Napełnij 125 μl sterylnego podłoża CRPMI w każdym dołku rzędu H jako kontrolę sterylności.
9. Weź pokrywkę kołka i przytrzymaj ją nad dnem talerza, tak aby kołki były skierowane w dół. Ostrożnie wyrównaj poszczególne kołki z odpowiednimi dołkami. Unikaj fizycznego kontaktu między płytą a kołkami. Po wyrównaniu ostrożnie opuść pokrywę w dół. Unikaj niewspółosiowości, ponieważ ponowna regulacja wykonana po dotknięciu kołków dolnej płyty może zanieczyścić kontrolę sterylności w rzędzie H.
10. Uszczelnij pokrywkę do talerza folią parafinową, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w zamykanej plastikowej torbie, szczelnie zamykając. Utrzymuj objętość powietrza w worku na jak najniższym poziomie, aby zminimalizować parowanie.
11. Inkubować bez wytrząsania w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ .
    Uwaga: 48 godzin wzrostu było optymalne dla S. aureus, ale będzie się różnić w zależności od użytego organizmu.
    nuta: Chociaż inkubacja statyczna jest dobrym punktem wyjścia do optymalizacji testu, delikatne wytrząsanie z prędkością 150 obr./min na wytrząsarce mikropłytek jest możliwą odmianą, która może zwiększyć tworzenie biofilmu niektórych izolatów S. aureus.

2. Przygotowanie płytki wyzwania biofilmu

1. W dniu, w którym odbywa się wyzwanie dotyczące biofilmu, należy wziąć świeżą 96-dołkową płytkę i dodać 100 μl CRPMI, zrównoważonej do RT, do każdej studzienki w rzędach od B do H. Aby uniknąć niespójnych wyników, należy użyć płytki 96-dołkowej, która może pomieścić 200 μl pożywki, gdy kołki znajdują się w środku, i zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm.
2. Rozcieńczyć oddzielnie do 4 badanych związków w 1,0 ml CRPMI do 2x pożądanego stężenia końcowego, w celu uwzględnienia końcowego rozcieńczenia w kroku 2.7.
   Uwaga: Dobrym punktem wyjścia jest 8-krotne zwiększenie stężenia hamującego komórek planktonowych.
3. Dodać 200 μl związku 1 w studzienkach A1 do A3, związku 2 w studzienkach A4 do A6, związku 3 w studzienkach A7 do A9 i związku 4 w studzienkach A10 do A12.
4. Szeregowo rozcieńczyć badane związki za pomocą pipety wielokanałowej i przenieść 100 μl z rzędu A do rzędu B i wymieszać.
5. W ten sposób kontynuuj przenoszenie 100 μl dobrze do dołka. Wymieszaj po każdym przeniesieniu i zatrzymaj w rzędzie F.
6. Po wymieszaniu wyrzucić 100 μl z rzędu F do pojemnika na odpady. Nie przelewaj żadnych płynów do rzędów G i H.
7. Dodać 100 μl CRPMI do każdego dołka płytki za pomocą pipety wielokanałowej, aby doprowadzić objętość do 200 μl. Patrz rysunek 1, aby zapoznać się z ostatecznym układem płyt.

3. Wyzwanie Biofilmu

1. Dodać 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do świeżej sterylnej płytki 96-dołkowej, która zawiera studzienki o wymiarach identycznych z wymiarami płytki inicjującej biofilm.
2. Usunąć plastikową torebkę i folię parafinową z inkubowanej płytki inicjującej biofilm
.
3. Podnieś pokrywę prosto do góry. Unikaj kontaktu kołków z dnem płytki, ponieważ może to spowodować uszkodzenie biofilmu. Zachowaj dolną część do późniejszej analizy OD₆₀₀ (patrz 3.8).
4. Spłukać komórki planktonu, umieszczając wieczko kołka na płytce zawierającej PBS (od kroku 3.1). Zanurz kołki na 5 sekund, wyjmij z PBS i zanurz się ponownie, uważając, aby nie uderzyć kołkami o boki studni.
5. Umieść wypłukaną pokrywkę kołka w talerzu wyzwania. Unikaj niepotrzebnego kontaktu kołków z dolną płytą, ponieważ spowoduje to uszkodzenie biofilmu, prowadząc do niespójnych wyników.
6. Uszczelnij płytkę folią parafinową i umieść ją w zamykanej plastikowej torbie, jak opisano w kroku 1.10.
7. Inkubować płytkę bez wstrząsania przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 .}
8. Pobrać dolną część płytki inicjującej biofilm z ppkt 3.3. Ponownie zawiesić bakterie w każdym dołku za pomocą pipety wielokanałowej i zmierzyć OD₆₀₀ za pomocą odpowiedniego czytnika mikropłytek, aby potwierdzić wzrost występujący we wszystkich studzienkach z wyjątkiem kontroli sterylności w rzędzie H.

4. Oznaczanie biofilmu

1. Użyć czytnika płytek wyposażonego w komorę inkubacyjną i zdolnego do wykonywania odczytów fluorescencji kinetycznej w celu wykrycia konwersji rezazuryny. Ustaw 24-godzinny pomiar fluorescencji kinetycznej przy użyciu wzbudzenia 530 nm i emisji 590 nm.
2. Ustaw temperaturę komory na 37 °C i odczytuj tabliczkę co 20 minut. Ustaw czytnik płytek tak, aby mierzył od spodu płytki zgodnie z instrukcjami producenta.
3. Przygotować płytkę myjącą, dodając 200 μl PBS za pomocą pipety wielokanałowej do sterylnej płytki 96-dołkowej.
4. Przygotować pożywkę do odzyskiwania biofilmu, dodając 400 μl 0,8 mg/ml roztworu podstawowego resazuryny do 20 ml pożywki CRPMI do końcowego stężenia 16 μg/ml resazurin.
   nuta: Rezazuryna jest znanym środkiem drażniącym skórę. Podczas obsługi używaj fartucha laboratoryjnego, okularów przeciwbryzgowych i rękawiczek. Zastosowano CRPMI jako pożywkę do odzyskiwania biofilmu, ponieważ zapewnia ona najniższy sygnał tła, ale w razie potrzeby można ją zastąpić pożywką Muellera Hintona.
5. Dodać 150 μl pożywki do odzyskiwania biofilmu za pomocą pipety wielokanałowej do każdego dołka świeżej 96-dołkowej płytki.
6. Przenieś płytkę prowokacyjną z inkubatora do komory bezpieczeństwa biologicznego i ostrożnie wyjmij plastikową torbę i folię uszczelniającą.
7. Zdjąć pokrywkę kołka z płytki prowokacyjnej i spłukać komórki planktonowe w PBS, jak opisano w ppkt 3.4. Zachowaj dolną część płytki prowokacyjnej do późniejszej analizy OD₆₀₀ (patrz 4.10).
8. Po spłukaniu umieść pokrywkę kołka w dnie płytki zawierającej pożywkę do odzyskiwania biofilmu.
9. Owiń bok płyty folią parafinową, uważając, aby nie zasłaniać dna studzienek obwodowych. Natychmiast po owinięciu płytki należy umieścić ją na czytniku płytek i rozpocząć odczyt kinetyczny w ciągu 24 godzin, inicjując wcześniej wykonany protokół kinetyczny reazuryny z kroku 4.1.
10. Aby określić ilościowo wzrost komórek planktonowych, które mogą, ale nie muszą wystąpić podczas prowokacji, odczytaj OD₆₀₀ całego dna płytki prowokacyjnej za pomocą czytnika mikropłytek. Postępuj zgodnie z instrukcjami podanymi w kroku 3.8.
    Uwaga: Ostrożnie ponownie zamieszaj zawartość każdej studzienki, ponieważ komórki zrzucające biofilm mają tendencję do wzrostu w kępach na dnie studzienki. Wszelkie pęcherzyki w studni będą silnie zakłócać odczyty OD₆₀₀ i należy ich unikać lub usunąć przed odczytem.

Wyniki

Rysunek 1. Układ tablic wyzwań. Przykładowy układ płytki prowokacyjnej umożliwiający równoległe testowanie czterech związków w trzech egzemplarzach w sześciu różnych stężeniach. Uwzględniono również kontrole niepoddane obróbce i sterylności. Konstrukcja układu umożliwia wygodne przygotowywanie rozcieńczeń seryjnych w płytce za pomocą pipety wielokanałowej. Stężenia podane są w μM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Średni Mueller-Hinton	Oxoid (Oxoid	Zobacz materiał CM0405	Postępuj zgodnie z zaleceniami producenta
RPMI-średni	Corning	17-105-CV
CRPMI (Fundusz CRPMI)	Odnośnik 9		RPMI-1640 średni cheleksed przez 1 godzinę z żywicą Chelex 100, a następnie uzupełniony 10% niechelekwasem RPMI-1640
Żywica Chelex 100	Bio Rad	142-2822
Płyty MBEC	Innovotech	Rocznik 19111
Sól sodowa resazuryny	Sigma	Czynnik R7017	800 μg / ml w sterylnym filtrze wody DI
Platforma do wytrząsania mikropłytek	Heidolph Titramax 1000
Cytat 3 Czytnik płyt	Biotek
Oprogramowanie Gen5	Biotek		Rejestracja i analiza konwersji resazuryny
Neomiedzi	Sigma	Zobacz materiał N1501	Przygotuj 10 mM zapasu w 100% etanolu, przechowuj w temperaturze -80 ºC
Siarczan miedzi	Acros Organics	Nr kat. 7758-99-8	Przygotować 100 mM roztwór podstawowy w wodzie, przechowywać w temperaturze 4 °C
Cu-neocuproine	Własnoręcznie wykonane		Wytwarzany przez zmieszanie równych molowców neomiedzi i siarczanu miedzi. Mieszaninę rozcieńczono w pożywce CRPMI do pożądanego stężenia.
Gentamycyna	Sigma	G3632-1G

)