1. Przygotowanie
- Poszycie komórkowe
nuta: W tym protokole wykorzystano ludzkie komórki nabłonka szyjki macicy, HeLa i HeLa eksprymujące histon 2B-GFP (H2B-GFP), ale test ten można dostosować do innych komórek ssaków.
- Odłącz przylegające komórki od kolby hodowlanej o średnicy 75cm2, przemłukując komórki 2 ml trypsyny-EDTA 0,25%. Zastąp zużytą trypsynę 2 ml świeżej trypsyny-EDTA 0,25%.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut, aż komórki zaokrąglą się i odłączą od kolby.
- Ponownie zawiesić komórki w 8 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
- Oznaczyć stężenie komórek za pomocą hemocytometru i 10 μl zawiesiny komórek.
- Rozcieńczyć komórki w pożywce wzrostowej do stężenia 2,5 x 105 komórek/ml.
- Wlać zawiesinę komórek do sterylnej miski na pipety i dokładnie wymieszać zawiesinę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
- Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl rozprowadź komórki HeLa (2,5 x 104 komórek/100 μl/dołek) w trzech (lub poczwórnych) na 96-dołkowej płaskiej, przezroczystej płytce z czarnym polistyrenem poddanym kulturze tkankowej, z 96 dołkami.
nuta: Układ poszycia przedstawiono jako przykład na rysunku 1.
- Hodować komórki przez 24 godziny w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przygotowanie roztworu podstawowego
- Przygotuj 1 l 10-krotnego zapasu buforu M (używanego do przygotowania M1 i M2), dodając 95 g zbilansowanego roztworu soli Hanksa, 0,476 g MgCl2 (5 mM) i 23,83 g HEPES (100 mM) do 900 ml wody. Dostosuj pH do 7,4 i zwiększ objętość do 1 l. Sterylizuj filtr.
- Przygotuj 50 ml 50-krotnego (1,25 M) zapasu glukozy, dodając 11,26 g D-(+)-glukozy do łącznie 50 ml wody. Filtruj wysterylizuj roztwór.
- Przygotuj 50 ml 100-krotnego (120 mM) zapasu wapnia, dodając 0,666 g CaCl2 do łącznie 50 ml wody. Filtruj wysterylizuj roztwór.
- Przygotować 50 ml 10x (50 mM) zapasu glikolu etylenowego-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N', kwasu tetraoctowego (EGTA), dodając 0,951 g EGTA do 40 ml wody. Zwiększ pH do 8 za pomocą NaOH w celu rozpuszczenia EGTA, a następnie zwiększ objętość do 50 ml. Filtruj wysterylizuj roztwór.
- Na pojedynczą 96-dołkową płytkę przygotuj 50 ml pożywki 1 (M1, zawiera Ca2+), 50 ml pożywki 2 (M2, Ca2+-free) i 15 ml pożywki 2 uzupełnionej EGTA, odpowiednio:
- W przypadku M1 dodaj 5 ml 10x buforu M, 0,5 ml 100x CaCl2 i 1 ml 50x glukozy do 43,5 ml wody.
- W przypadku M2 dodaj 5 ml 10x buforu M i 1 ml 50x glukozy do 44 ml wody.
- W przypadku M2/EGTA dodać 1,5 ml 10x buforu M i 1,5 ml 10x EGTA do 12 ml wody.
nuta: Wszystkie roztwory zawierające jodek propidyny (PI) należy przygotować bezpośrednio przed dodaniem do komórek.
- Ustawienia czytnika płytek/cytometru obrazowego
nuta: Stosować wielotrybowy czytnik płytek wyposażony w dwie jednostki detekcyjne: spektrofluorometr i cytometr obrazowy. Ogranicz ekspozycję na fluorescencję, aby uniknąć fotowybielania fluoroforów.
- Przed wykonaniem testu należy wstępnie ogrzać czytnik płytek do temperatury 37 °C.
- Ustaw odpowiednio parametry testu kinetycznego w trybie ustawień:
- Wybierz Monochromator, FL (fluorescencja) i Kinetyczny odpowiednio dla konfiguracji optycznej, trybów odczytu i typu odczytu.
- W obszarze Wavelength Settings (Ustawienia długości fali) wybierz odpowiednio pasmo wzbudzenia i emisji 9 i 15 nm. W przypadku testów z użyciem jodku propydu (PI) należy ustawić długości fal wzbudzenia i emisji odpowiednio na 535 i 617 nm.
- W obszarze Typ płyty wybierz 96 dołków dla formatu płyty i wstępnie ustawioną konfigurację płyty odpowiadającą przezroczystej płycie dolnej o czarnych ściankach.
- W obszarze Obszar odczytu zaznacz studnie, które będą analizowane w całym obszarze kinetycznym.
- W obszarze PMT i optyka ustaw błyski na odczyt na 6 i zaznacz pole Czytaj od dołu.
- W obszarze Czas wstaw 00:30:00 w polu Całkowity czas wykonywania dla 30-minutowego testu kinetycznego i wstaw 00:05:00 dla interwału.
Uwaga: Dla każdego punktu czasowego i jednej długości fali czas odczytu pełnej płytki 96-dołkowej wynosi 30 s.
- Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach po prawej stronie i wybierz przycisk OK. Naciśnij przycisk Czytaj, aby rozpocząć bieg kinetyczny.
- Ustaw odpowiednio parametry obrazowania w trybie ustawień:
- Wybierz Minimax, Imaging i Endpoint odpowiednio dla konfiguracji optycznej, trybów odczytu i typu odczytu.
- W obszarze Długości fal wybierz światło przechodzące oraz jedno lub oba pola fluorescencji odpowiadające długościom fal wzbudzenia i emisji 456/541 nm (GFP) i 625/713 nm (PI).
- Użyj tych samych opcji dla Typu płyty i Obszaru odczytu, jak zdefiniowano w krokach 1.3.2.3 i 1.3.2.4.
- W polu Ustawienie obszaru studni wybierz liczbę miejsc w studni, które mają zostać zobrazowane.
Uwaga: 12 miejsc odpowiada obrazowi z pełną studnią.
- W obszarze Image Acquisition Settings (Ustawienia akwizycji obrazu) wybierz czasy ekspozycji dla światła przechodzącego, 541 (GFP) i 713 (PI). W przypadku GFP należy zobrazować całą studnię z czasem naświetlania 20 ms/obraz. W przypadku fluorescencji światła przechodzącego (TL) i PI należy uzyskać pojedynczy obraz środka każdej studzienki z czasami naświetlania wynoszącymi odpowiednio 8 i 20 ms.
- Potwierdź określone ustawienia w informacjach o ustawieniach po prawej stronie i wybierz przycisk OK. Czas akwizycji dla zobrazowania całej powierzchni każdego dołka (12 obrazów/dołek) płytki 96-dołkowej i dla jednej długości fali wynosi ~15 min. Naciśnij przycisk Czytaj, aby rozpocząć obrazowanie.
Uwaga: Czas akwizycji pojedynczego obrazu/dołka z 96-dołkowej płytki wymaga ~2,5 min/płytkę dla jednej długości fali. Opisane powyżej parametry odpowiadają konkretnemu sprzętowi w naszym laboratorium. Pomiary spektrofluorometryczne: Ksenonowa lampa błyskowa wyświetlająca długość fali wzbudzenia z przyrostem 1,0 nm (250-850 nm) z regulowanym pasmem przepustowym 9 lub 15 nm, detektor lampy fotopowielacza o zakresie dynamiki > 6 log oraz regulowany pasmo przepustowe emisji 15 lub 25 nm. Cytometr obrazujący: Źródło światła podświetlającego zdolne do światła białego, długości fal wzbudzenia 460 nm i 625 nm z pasmem przepustowym 20 nm, filtrami emisyjnymi wyśrodkowanymi odpowiednio na 541 nm (pasmo przepustowe 108 nm) i 713 nm (pasmo przepustowe 123 nm) oraz obiektyw 4X sprzężony z 1,25-megapikselową 12-bitową kamerą urządzenia sprzężoną z ładowaniem.
2. Test
Uwaga: W czasie testu, komórki muszą być w 70-90% zlewne. Podczas etapów mycia podłoże należy usunąć i nałożyć na boczną ścianę studzienki (nie bezpośrednio nad komórkami). Utrzymać temperaturę LLO na poziomie < 4 °C, aby zapobiec jego agregacji do etapu 3.1.5.
- Przygotować zapas 30 μM PI w M1 i zapas 30 μM PI w M2 wstępnie ogrzany w temperaturze 37 °C.
- Delikatnie umyj komórki na płytce 1 za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl, w następujący sposób:
- W przypadku warunków permisywnych należy usunąć pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki 200 μl/studzienkę M1 wstępnie podgrzaną w temperaturze 37 °C. Zastąp pożywkę 100 μl/studzienkę ciepłego M1 zawierającego 30 μM PI.
- W celu naprawy warunków restrykcyjnych należy usunąć pożywkę wzrostową i przemyć komórki raz 200 μl/dobrze ogrzany M2 zawierający 5 mM EGTA w celu chelatacji Ca2+, a następnie raz przemyć 200 μl / basenik M2. Zastąp pożywkę 100 μl/dobrze ciepłym M2 zawierającym 30 μM PI.
- Po umyciu pożywki wzrostowej i zastąpieniu jej pożywką zawierającą jodek propidyny, należy bezpośrednio przejść do kroku 2.1.3.
- Płyta obrazowa 1 w świetle przechodzącym, GFP i PI, jak opisano w 1.3.3 (prekinetyczny). Ten krok zajmuje 15-20 minut.
- W ciągu 15 minut, o których mowa w kroku 2.1.3, przygotować płytkę 2 za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl w następujący sposób:
- Umieść 96-dołkową mikropłytkę polipropylenową z okrągłym dnem na lodzie. Skonfiguruj płytę, korzystając z projektu eksperymentalnego odpowiadającego płycie 1 (rysunek 1).
- W przypadku warunków dopuszczających naprawę dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 60 μM PI, a następnie dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M1 zawierającego 4x LLO lub nie dla kontroli.
- W przypadku warunków ograniczających naprawę, dodać 100 μl/basenik lodowatego M2 zawierającego 60 μM PI, a następnie dodać 100 μl/studzienkę lodowatego M2 zawierającego 4x LLO lub nie do kontroli.
- Po zobrazowaniu płytki 1 (krok 2.1.3) natychmiast umieść ją na lodzie, używając folii aluminiowej w celu oddzielenia płytki od bezpośredniego kontaktu z lodem. Pozostaw płytkę 1 do ostygnięcia przez 5 minut.
- Za pomocą 12-kanałowej mikropipety i końcówek o pojemności 200 μl przenieść 100 μl z każdej studzienki na płytkę 2 (etap 2.1.4) do odpowiednich studzienek w płytce 1. Aby prawidłowo rozprowadzić toksynę w pożywce płytki 1, włóż końcówki poniżej łąkotki i delikatnie wysuń objętość bez wprowadzania pęcherzyków.
Uwaga: Nie należy pipetować w górę i w dół, ponieważ może to spowodować przypadkowe odłączenie komórek.
- Pozostawić płytkę na dodatkową 1 minutę, aby toksyna mogła związać się z komórkami i natychmiast przenieść płytkę 1 do czytnika płytek w celu przeprowadzenia testu kinetycznego w trybie spektrofluorometru (krok 1.3.2).
- Na zakończenie testu kinetycznego natychmiast należy naświetlić płytkę 1 (postkinetyczną), wykonując krok 1.3.3.
3. Analiza: Wyliczanie komórek
- Określ liczbę komórek na podstawie fluorescencji jądrowej za pomocą oprogramowania do liczenia komórek na mikropłytkach.
- W obszarze Ustawienia wybierz opcję Ponowna analiza, a następnie w sekcji kategorii w obszarze Ustawienia analizy obrazu wybierz opcję Dyskretna analiza obiektów przy użyciu długości fali 541 do znajdowania obiektów.
- W opcji Znajdź obiekty, korzystając z metody wyszukiwania Rysuj na obrazach, wybierz Jądra na karcie ustawień i naciśnij Zastosuj.
- Naciśnij OK i odczyt, aby zainicjować algorytm zliczania komórek.
