Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Utrwalanie tkanek w formalinie
- Umieść 3-5 mm tkanki mózgowe pobrane po sekcji zwłok w 10% buforowanym fosforanem roztworze formaliny (stosunek 1:20 do 1:50 tkanka / formalina) przez 24-72 h.
ostrożność: Formalina jest toksycznym utrwalaczem.
- Zapisz przybliżoną masę (rozmiar) tkanki, typ tkanki (obszary mózgu) i objętość formaliny. Ważne jest, aby laboratoria dokumentowały i prowadziły zapisy dotyczące czasów utrwalania.
- W celu dłuższego przechowywania tkanek po utrwaleniu formaliny i przed przetworzeniem należy umieścić tkankę w 70% etanolu.
2. Przetwarzanie tkanek
- Po utrwaleniu próbki należy przeciąć tkankę, aby uwzględnić ważne obszary mózgu, np. przekroje pnia mózgu, móżdżku (3 płaty) lub hipokampa (oba hipokampy), z których każdy ma grubość od 3 do 5 mm i umieszcza w kasetach do obróbki.
- Przetwarzać kasety tkankowe do infiltracji wosku parafinowego, osadzone w blokach parafinowych i podzielone (3 do 6 μm) na mikrotomie.
3. Przygotowanie materiałów / Barwienie naczyń
- Ustaw naczynie do barwienia (tabela materiałów), jak pokazano na rysunku 1. Napełnij każde naczynie 250 ml roztworu.
- Przygotowanie roztworu podstawowego substratu 3-amino-9-etylokarbiizolu (AEC)
- Rozpuścić jedną tabletkę 20 mg 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) w 5 ml N,N, dimetyloformamidu za pomocą szklanej pipety.
ostrożność: AEC jest czynnikiem rakotwórczym.
- Przygotowanie roztworu podstawowego proteazy (np. pronazy) do pobrania antygenu
- Rozpuścić 7 mg proteazy w 200 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
- Przygotowanie buforu płuczącego PBS-T
- Dodaj 10 ml Tween 80 do 990 ml PBS. Dobrze wymieszaj, aby uzyskać jednorodny roztwór.
4. Deparafinizacja i rehydratacja tkanek
- Wykonać skrawek parafiny o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu, umieścić go na łaźni wodnej w temperaturze 38 °C i zebrać na szkiełkach podstawowych. Oznacz szkiełka pisakiem/markerem odpornym na odczynniki.
- Umieść szkiełka na blasze i rozpuść w piekarniku o temperaturze 55-60 °C przez 1 godzinę. Nie należy podnosić temperatury powyżej 60 °C, ponieważ może to zniszczyć antygen wirusowy.
- Wyjmij szkiełka z piekarnika i natychmiast odparafinowaj w 3 kolejnych płukaniach ksylenu po 5 minut każde w naczyniach 1, 2 i 3.
- Ponownie uwodnić sekcje na szkiełku poprzez sekwencyjne zanurzenie w zmniejszającym się rozcieńczeniu etanolu do wody dejonizowanej: (4 do 11 to płukanie zanurzeniowe) danie 4: ksylen/100% etanol (1:1); danie 5: 100% etanolu; danie 6: 100% etanolu; danie 7: 95% etanolu; danie 8: 95% etanolu; danie 9: 80% etanolu; danie 10: 70% etanolu; danie 11: woda dejonizowana (rysunek 1. Ustawienie talerza).
ostrożność: Ksylen jest niebezpieczną substancją chemiczną i prace powinny być wykonywane pod wyciągiem.
5. Pobieranie antygenu proteolitycznego
- Traktować szkiełka proteazą (2,5 μg/ml PBS) przez 30 minut w celu pobrania antygenu proteolitycznego w naczyniu 12.
- Następnie płucz w PBS-T przez 10 minut (danie 13).
- Traktuj 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut (danie 14).
- Ponownie myj PBS-T przez 10 minut (danie 15).
6. Procedura barwienia
- Szkiełka należy obsługiwać pojedynczo, trzymając pozostałe prowadnice zanurzone w buforze (nie wyjmuj całego uchwytu prowadnicy - prowadnice powinny być mokre). Usuń jedno szkiełko podstawowe i zetrzyj nadmiar buforu (za pomocą ręcznika papierowego) z okolic sekcji tkanki, uważając, aby nie naruszyć fragmentu tkanki. Inkubować szkiełka w komorze wilgotnościowej, wykonanej przez umieszczenie zwilżonych ręczników papierowych, na blacie stołu laboratoryjnego w temperaturze pokojowej z normalną kozią surowicą (blokowanie) przez 15 minut.
- Inkubować z optymalnym, wstępnie ustalonym rozcieńczeniem, pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko wściekliźnie (rozcieńczenie 1:250 mysiej surowicy przeciwko wściekliźnie, nieopublikowane) (kontrola pozytywna) i ujemnymi przeciwciałami kontrolnymi w temperaturze pokojowej takiej samej jak powyżej (krok 6.1.) przez 60 minut, bez przemywania pomiędzy nimi.
- Po 60 minutach myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
- Inkubować z biotynylowanym przeciwciałem (specyficznym dla gatunku) w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (postępowanie takie samo jak w kroku 6.1.).
- Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
- Inkubować z kompleksem Streptawidyna - peroksydaza chrzanowa (HRP) w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 15 minut (obchodzenie się z roztworem jak w ppkt 6.1.).
- Myć PBS-T przez 10 minut (danie 16).
- Inkubować z substratem peroksydazy, aminoetylokarbazolem (AEC), w komorze wilgotnościowej w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Wykonać AEC tuż przed użyciem. W tym celu dodaj 1 ml roztworu podstawowego AEC do 14 ml 0,1 M buforu octanowego o pH 5,2. Dodać 0,15 ml 3% nadtlenku,H2O2. Przefiltrować mieszaninę tuż przed użyciem (filtr 0,45 μm).
nuta: Roztwór roboczy AEC jest stabilny tylko przez 2-3 godziny. Roztwór podstawowy AEC może być przechowywany w lodówce przez dłuższy czas.
- Myć w wodzie dejonizowanej przez 10 min (danie 17)
- Barwione przeciwstawnie hematoksyliną Gilla rozcieńczone w stosunku 1:2 wodą dejonizowaną przez 2 minuty (danie 18).
- Nadmiar hematoksyliny spłukać wodą dejonizowaną, spłukać zanurzeniowo (naczynia 19 i 20).
- Opłucz w wodzie Scott's Tap przez 30 s (roztwór niebieszczący) naczynie 21.
- Myć w wodzie dejonizowanej przez 10 min (danie 22)
- Zdejmuj szkiełka pojedynczo - zamontuj za pomocą rozpuszczalnego w wodzie medium montażowego.
- Czytaj slajdy pod mikroskopem świetlnym.
