$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Przygotowanie histopatologiczne i przetwarzanie po uzyskaniu biopsji tętnicy skroniowej
UWAGA: Biopsja tętnicy skroniowej (TAB) jest wykonywana w znieczuleniu miejscowym i sterylnych warunkach przez certyfikowanego chirurga. Po chirurgicznym uzyskaniu 3-centymetrowego odcinka tętniczego po bardziej dotkniętej stronie, próbkę natychmiast utrwala się w formalinie na 24 godziny, dzieli na odcinki od 3 do 4 mm i zatapia w parafinie, zwracając szczególną uwagę na prawidłowe ułożenie tkanki w bloku, który jest następnie przechowywany w temperaturze pokojowej. Selekcja próbek odbywa się po weryfikacji dokumentacji medycznej. Diagnoza opiera się na kryteriach American College of Rheumatology z 1990 roku, które wymagają, aby badani spełniali 3 z 5 domen: wiek >50 lat, nowy ból głowy, tkliwość tętnicy skroniowej, szybkość sedymentacji erytrocytów >50 mm/godzinę metodą Westergrena i nieprawidłowa TAB. Ze względów bezpieczeństwa podczas pracy z próbkami należy nosić rękawice ochronne, chemikalia i przeciwciała.
- Z osadzonych bloków wyciąć odcinki o grubości 4-5 μm za pomocą mikrotomu i wybarwić hematoksyliną i eozyną (H&E). Użyj przekroju kontrolnego wybranej normalnej tkanki w celu zapewnienia jakości.
- Na ciepłej łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 40 °C należy wyciąć skrawki pływakiem, a następnie zebrać je za pomocą mikroskopijnego szkiełka z powlekanym szkiełkiem. Umieścić szkiełka podstawowe na ciepłej płycie w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 minut, aby ułatwić suszenie i przyleganie części do szkiełka.
- Umieść szkiełka podstawowe na ciepłym talerzu w piekarniku o temperaturze 60 °C na 60 minut, aby ułatwić suszenie i przyleganie części do szkiełka.
- Zamontuj 3 sekcje na szkiełkach mikroskopowych.
- Umieść szkiełka w pionowym ruszcie i susz przez noc w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
- Umieścić szkiełka w pojemniku i przechowywać w temperaturze 4 °C.
2. Przygotowanie immunohistochemiczne, odparafinowanie, pobieranie antygenu i barwienie
- Załaduj prowadnice do stojaka na prowadnice. Przełóż ruszt przez naczynia w następujący sposób: dwa razy w 100% ksylenie przez 5 minut z 10 sekundami delikatnego mieszania co 30 sekund, raz w 100% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu, raz w 90% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu, raz w 70% etanolu po 10 sekundowym mieszaniu i dwa razy w podwójnie destylowanymH2Opo 10 sekundowym mieszaniu.
nuta: Obchodzenie się z ksylenem i acetonem powinno odbywać się w wentylowanych kapturach, aby uniknąć wdychania i toksyczności dla dróg oddechowych.
- Pobrać antygen, przenosząc stojak do szklanego pojemnika z 200 ml buforu cytrynianowego o pH 10 mmol/l, pH 6,0 podgrzanym do 95 °C. Ustaw minutnik na 30 minut w łaźni wodnej, następnie schładzaj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie płucz bieżącą wodą przez 5 minut.
- Usuń endogenną aktywność peroksydazy, inkubując w 200 ml 3% nadtlenku wodoru przez 10 minut. Przemyć szkiełka 3 razy w 200 μl roztworu soli fizjologicznej buforowanego Tris (TBSS).
- Wyjmij szkiełka ze stojaka i delikatnie przetrzyj każdą z nich, aby usunąć nadmiar buforu. Do barwienia dodać 200 μl następujących przeciwciał pierwszorzędowych, dodać szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej:
Przeciwciało przeciwko receptorowi kwasu foliowego beta (FRB) rozcieńczone 1:800
Monoklonalny mysi anty-ludzki CD68, rozcieńczenie 1:200
Poliklonalny królik anty-CD3 rozcieńczenie 1:100
nuta: Utrwalone w formalinie odcinki łożyska zatopione w parafinie również przetworzono, jak opisano w krokach 2.1 do 2.9, a następnie inkubowano z anty-FRB18 i zastosowano jako kontrolę pozytywną. Wyniki barwienia uzyskano poprzez znalezienie optymalnego stężenia przeciwciał i przeprowadzono je poprzez miareczkowanie przeciwciała w podwójnych rozcieńczeniach (np. 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600).
- Po inkubacji usunąć szkiełko nakrywkowe i wyrzucić. Opłucz szkiełka 3 razy po 2 minuty za pomocą TBSS, odcedź i wytrzyj nadmiar buforu.
- Dodać 200 μl roztworu przeciwciała drugorzędowego zawierającego biotynylowane przeciwciało drugorzędowe anty-królika/myszy, aby zareagować z niesprzężonym przeciwciałem pierwszorzędowym związanym z antygenem tkankowym. Umieść szkiełka nakrywkowe na szkiełkach i inkubuj w wilgotnej komorze przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
- Po inkubacji usunąć szkiełko nakrywkowe i wyrzucić. Opłucz szkiełka 3 razy po 2 minuty za pomocą TBS, odcedź i wytrzyj nadmiar buforu.
- Dodać 200 μl systemu diaminoferydyny (DAB) + buforu substratowego (Imidazol HCl) -chromogenu i inkubować przez 10 minut, aby uwidocznić wzór barwienia. Myć TBSS, a następnie pod bieżącą wodą z kranu przez 10 minut.
- Przeciwbarwić hematoksyliną przez 3 minuty.
- Zamontuj szkiełka, nakładając 70 μL medium montażowego na powierzchnię szkiełka. Powoli przechylaj szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe i unikaj tworzenia pęcherzyków podczas opuszczania go na miejsce. Odczekaj 24 godziny do wyschnięcia.
3. Analiza histopatologiczna i immunohistochemiczna (IHC)
Zbadaj wybarwione skrawki H&E i IHC od osób z pozytywnym wynikiem GCA i normalnych za pomocą mikroskopu świetlnego.
- Do sekcji barwionych H&E
- Oceń architekturę naczyniową i zidentyfikuj komórki śródbłonka w osłonce wewnętrznej, komórki mięśni gładkich w osłonce środkowej oraz fibroblasty i naczynia krwionośne w osłonce przydankowej.
- Zidentyfikuj cechy GCA, które obejmują infiltrację limfocytów i makrofagów/histiocytów, przerost komórkowy i degradację wewnętrznej blaszki elastycznej.
- Przeanalizuj naciek limfohistiocytarny, identyfikując i określając ilościowo liczbę makrofagów w stosunku do limfocytów. Oceń zakres rozerwania wewnętrznej blaszki elastycznej i zmian hiperplastycznych w komórkach rezydentnych i porównaj je z kontrolami.
- Do sekcji barwionych IHC
- Zbadaj wzór barwienia FRB, zwracając uwagę na jego ekspresję przez określony typ lub typy komórek oraz jego rozmieszczenie w warstwach naczyniowych i jego związek z całkowitym naciekiem immunologicznym, całkowitym markerem makrofagów, anty-CD68 i markerem limfocytów panowych anty CD3.
- Określ ilościowo ekspresję komórek FRB, CD68 i CD3, licząc dodatnio wybarwione komórki na 10 wielu losowo wybranych polach dużej mocy (hpf) i zapisz średnie.
nuta: Identyfikacja tych normalnych i patologicznych komórek i struktur została przeprowadzona przez certyfikowanego patologa sercowo-naczyniowego i reumatologa, a wyniki zostały zarejestrowane dla wszystkich przypadków.
- Przechwytywanie reprezentatywnych obrazów za pomocą aparatu cyfrowego.
UWAGA: Po wykonaniu tych czynności pozostałe porcje można przechowywać w temperaturze -80 °C.