$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z modelami zwierzęcymi zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Pobieranie tkanek i sieciowanie UV
- Poddaj eutanazji 2 dorosłe myszy za pomocą dwutlenku węgla (CO2 ) przez 1-2 minuty lub do momentu ustania oddychania. Następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy na każdej myszy.
- Zbierz około 100 mg jąder od myszy w odpowiednim wieku (jedno dorosłe jądro w tym badaniu) do każdego eksperymentu immunoprecypitacji i umieść tkanki w lodowato zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Delikatnie usuń osłonkę białawą za pomocą jednej pary pęset z cienką końcówką.
- Dodaj 3 ml lodowatego PBS do młynka do tkanek i rozcieraj tkankę za pomocą łagodnej siły mechanicznej za pomocą luźnego szklanego tłuczka (tłuczek szklany typu A).
UWAGA: Celem tego etapu nie jest liza komórek, ale rozerwanie tkanki. Ważne jest zachowanie żywotności i integralności komórek.
- Przenieść zawiesinę tkankową do naczynia do hodowli komórkowych (o średnicy 10 cm) i dodać lodowaty PBS do 6 ml.
- Szybko potrząśnij talerzem, aby płyn równomiernie pokrył dno naczynia. Jeśli tkanka zostanie odpowiednio zmielona, widoczne będą równomiernie rozmieszczone kanaliki nasienne, natomiast obecność grudek tkanek wskazuje, że dyspersja tkanek jest nieoptymalna.
- Trzykrotnie sieciować zawieszenie z prędkością 400 mJ/cm2 przy długości fali 254 nm na lodzie. Mieszać zawiesinę między każdym napromieniowaniem.
nuta: Dla każdego nowego eksperymentu sieciowanie powinno być optymalizowane.
- Zebrać zawiesinę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadu o pojemności 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS, a następnie przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Wirować w temperaturze 4 °C i masie 1 000 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
- W tym momencie natychmiast przejdź do reszty protokołu lub zamroź granulki w ciekłym azocie i przechowuj je w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Przygotowanie koralików
- Dodać 125 μl kulek magnetycznych białka A na próbkę (osad) do świeżej probówki wirówkowej.
nuta: Użyj kulek magnetycznych białka G dla przeciwciał myszy.
- Umieść rurkę na magnesie, aby oddzielić kulki od roztworu. Po 10 s usunąć supernatant. Umyj kulki dwukrotnie 1 ml lodowatego buforu do lizy.
nuta: Kolejnym krokiem jest oddzielenie kulek magnetycznych białka A. Skład buforu do lizy to 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholan sodu; 1/50 Koktajl inhibitorów proteazy bez kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (dodać świeży).
- Zawiesić kulki w 100 μl buforu do lizy na zimno z 10 μg przeciwciała eCLIP. Obracaj probówki w temperaturze pokojowej przez 45 min.
nuta: Końcowe stężenie przeciwciał do immunoprecypitacji wynosi 10 μg/ml. Jeśli stężenie przeciwciał jest nieznane, należy zoptymalizować ilość przeciwciał.
- Umyj kulki dwukrotnie 1 ml lodowatego buforu do lizy
.
3. Liza tkanek i częściowe trawienie RNA
- Zawiesić osady tkankowe w 1 ml zimnego buforu do lizy (dodać 22 μl koktajlu inhibitorów białek wolnych od 50x (EDTA) i 11 μl inhibitora RNazy do 1 ml buforu do lizy).
- Zawiesić dwie granulki usieciowane promieniami UV i dwie granulki nieusieciowane na grupę eksperymentów: granulki usieciowane promieniami UV 1 dla biblioteki eCLIP (UV-1); Granulki UV-crosslinked-2 do biblioteki eCLIP (UV-2); granulki nieusieciowane 1 do biblioteki eCLIP jako kontrola (bez UV); nieusieciowane 2 granulki dla IgG IP w celu wykazania specyficzności przeciwciał.
nuta: Idealną kontrolą dla biblioteki eCLIP dla usieciowanych promieniami UV jąder szerokokątnych jest kontrola jąder nokautujących usieciowanych promieniami UV od myszy z tego samego miotu.
- Utrzymuj lizę próbek na lodzie przez 15 minut (aby zapobiec degradacji białka i RNA).
- Sonikować w cyfrowym sonikatorze przy amplitudzie 10% przez 5 minut, po 30 s włączenia/30 s wyłączenia. Zawsze umieszczaj próbkę na lodzie i czyść sondę wodą wolną od nukleaz między każdą próbką.
- Dodaj 4 μl DNazy do każdej probówki i dobrze wymieszaj. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
- Dodać 10 μl rozcieńczonej RNazy I (4 μl RNazy I w PBS) i dobrze wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C, wytrząsając z prędkością 1 200 obr./min.
- Oczyścić lizat przez odwirowanie w temperaturze 15 000 x g przez 20 minut (w temperaturze 4 °C).
- Ostrożnie zebrać supernatant. Pozostaw 50 μl lizatu i wyrzuć wraz z nim osad.
- Próbki wejściowe należy zapisywać jako RWB (run dla western blot) i RRI (run dla izolacji RNA). Zaoszczędź 20 μl (2%) próbek UV-1, UV-2, nie-UV i IgG jako dane wejściowe do ładowania żelu RWB. Zaoszczędź 20 μl (2%) próbek UV-1 lub UV-2 jako dane wejściowe do ładowania żelu RRI.
4. Immunoprecypitacja
- Dodać 1 ml lizatu (z kroku 3.7) do kulek (przygotowanych w sekcji 2) i obracać próbki w temperaturze 4 °C przez 2 godziny lub przez noc.
- Zbierz koraliki za pomocą podstawki magnetycznej i wyrzuć supernatant. Przemyć kulki dwukrotnie 900 μl buforu o wysokiej zawartości soli (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% deoksycholanu sodu), a następnie dwukrotnie przemyć kulki 900 μl buforu do przemywania (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).
nuta: W przypadku próbki IgG należy w tym miejscu wstrzymać procedurę i przechowywać ją na lodzie w buforze do przemywania się.