$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie materiałów do iniekcji
- Wysterylizować igłę i strzykawkę o strzale 33 G: zdemontować i sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 οC. Przygotować igły do wstrzykiwań, podnosząc je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Rozmrażać fluorescencyjnie znakowane cząstki w temperaturze pokojowej przez 5 - 10 minut. Przygotować roztwór cząstek do wstrzykiwań, rozpuszczając go do roztworu o stężeniu 50 mg/ml w sterylnym PBS z jonem wapnia i jonem magnezu (Ca2+/Mg2+).
nuta: W tym protokole stosuje się cząstki pochodzenia grzybowego znakowane AF488, które zostały zwalidowane do testów fagocytozy. W celu optymalnego wchłaniania należy przygotować cząsteczki świeże i bezpośrednio przed wstrzyknięciem.
UWAGA 2: Stężenia cząstek mogą być optymalizowane dla każdego konkretnego eksperymentu.
2. Doszklistkowe wstrzykiwanie roztworu kulek
UWAGA: Dwie osoby są wymagane do wykonania iniekcji, w taki sposób, że osoba wykonująca wstrzyknięcie może trzymać mysz i utrzymywać skupienie na gałce ocznej, podczas gdy druga osoba podaje załadowaną strzykawkę i naciska tłok.
- Znieczulić gryzonia przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 100 mg/ml ketaminy i 10 mg/ml ksylazyny w dawce 20 μl/10 g masy ciała. Przed wstrzyknięciem należy uszczypnąć palec u nogi, aby ocenić poziom znieczulenia.
nuta: Izofluran ma głęboki wpływ na funkcję komórek szpikowych, dlatego należy unikać jego stosowania w tym teście.
- Załadować igłę 0,5 μl znakowanego fluorescencyjnie roztworu cząstek.
- Połóż mysz bokiem pod mikroskopem chirurgicznym (ryc. 1A-B). Użyj miękkiego materiału, np. wkładu żelowego, dla lepszego ułożenia myszy. W przypadku młodych myszy, u których oczy nie są jeszcze otwarte, delikatnie otwórz powieki za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, tworząc szczelinę wzdłuż szczeliny, z której powieki ostatecznie się otworzą.
- Za pomocą cienkich kleszczyków ustawionych pod kątem 45o ostrożnie dociśnij okolice powieki, tak aby gałka oczna lekko wyskoczyła z oczodołu. Przytrzymaj głowę dwoma palcami tuż nad uchem i za szczękę i delikatnie rozciągnij skórę równolegle do powiek, aby oko było lekko poza oczodołem. Uważaj, aby nie chwycić zbyt blisko gardła (Rysunek 1B).
- Aby przebić gałkę oczną, należy włożyć igłę strzykawki w rąbek rogówki (w miejscu, w którym rogówka i twardówka łączą się). Jest to widoczne jako szare kółko u pigmentowanych myszy. Lekko wycofać igłę, aby usunąć niewielką objętość płynu szklistego, a następnie wstrzyknąć. Osoba wykonująca wstrzyknięcie powinna delikatnie trzymać jedną ręką mysz, a drugą igłę; Druga osoba powinna powoli naciskać tłok.
- Powoli wycofać strzykawkę. Stosuj krople nawilżające do oczu, aby utrzymać nawilżenie oka.
- Pozwól gryzoniowi dojść do siebie w klatce nad poduszką grzewczą i kontynuuj monitorowanie zwierzęcia. Jeśli pracujesz ze szczeniętami, nie umieszczaj zwierzęcia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie zacznie oddychać i nie będzie zdolne do spontanicznych ruchów. Jeśli pracujesz z dorosłymi, nie umieszczaj gryzonia w klatce z innymi czujnymi zwierzętami, dopóki nie odzyska pozycji mostka.
3. Pobieranie tkanki siatkówki
UWAGA: Tkanka siatkówki z oczu, do której nie wstrzyknięto fluorescencyjnie znakowanych cząstek, powinna być pobierana jako kontrola do analizy cytometrycznej przepływowej. Chociaż test można wykonać przy użyciu pojedynczej siatkówki, aby uzyskać najlepszą wydajność, dwie siatkówki powinny być połączone razem.
- Pobrać tkankę siatkówki 3 godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego fluorescencyjnie znakowanych cząstek.
nuta: Chociaż czas po wstrzyknięciu roztworu cząstek może być zoptymalizowany dla każdego konkretnego eksperymentu, stwierdziliśmy, że 3 godziny po wstrzyknięciu wychwyt cząstek można było zaobserwować w większości warstw siatkówki (ryc. 1C-D).
- Ofiaruj myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Zbierz gałki oczne, delikatnie naciskając na powiekę za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o, aby podeprzeć gałkę oczną. Umieść kleszcze za gałką oczną i pociągnij.
- Wypreparuj siatkówkę pod mikroskopem preparacyjnym. Przenieść gałkę oczną na szalkę Petriego zawierającą niewielką ilość PBS z Ca2+/Mg2+. W suchym miejscu szalki Petriego przebij gałkę oczną w rąbku rogówki końcówką bardzo cienkich kleszczyków.
- Przytrzymaj gałkę oczną za pomocą cienkich kleszczy pod kątem 45o i użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wokół rąbka rogówki, aż zostanie przecięta mniej więcej połowa obwodu rąbka rogówki.
- Przytrzymaj gałkę oczną cienkimi kleszczami pod kątem 45o i wprowadź gałkę oczną do PBS. Drugą parą cienkich kleszczy pod kątem 45o rozerwij rogówkę i twardówkę. Soczewka i siatkówka wyjdą nienaruszone.
- Oddziel soczewkę i siatkówkę. Zbierz siatkówkę i przenieś ją do probówki z polistyrenu o pojemności 5,4 ml zawierającej 2 ml PBS z Ca2 + / Mg2 +.
4. Przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej
- Przygotuj zawiesiny jednokomórkowe za pomocą zestawu do dysocjacji tkanki neuronalnej z niewielkimi modyfikacjami w stosunku do instrukcji producenta. Krótko mówiąc, rozcierać siatkówki, pipetując w górę i w dół pipetą P1000 i przeprowadzając trawienie enzymatyczne w temperaturze 37 oC bez wstrząsania.
5. Barwienie zawiesin pojedynczych komórek do analizy cytometrycznej przepływowej
- Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu barwiącego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco z 0,2% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 0,09% azydkiem sodu) i przenieść na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U. Wirować przez 5 minut przy 130 x g.
nuta: Azydek sodu jest szkodliwy dla ludzi i środowiska. Używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i wyrzucaj odpady zgodnie z lokalnymi przepisami.
- Odwróć talerz nad zlewem, aby wyrzucić supernatant. Aby zablokować receptory Fc, należy ponownie zawiesić komórki w 25 μl buforu barwiącego zawierającego 5 μg/ml przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 na dołek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać 25 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6C-APC-Cy7, 0,5 μg/ml anty-mysiego Ly6G-Pe-Cy7 i 2,5 μg/ml anty-mysiego CD11b-BV650. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
- Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Odwrócić płytkę, aby wyrzucić supernatant. Przemyć przez ponowne zawieszenie komórek w 200 μl buforu barwiącego.
- Wirować przez 5 minut przy 130 x g. Zawiesić w 200 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml jodku propidyny (PI). Przenieść do probówek do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml.
- Przemyć studzienki dodatkowymi 100 μl buforu barwiącego zawierającego 0,5 μg/ml PI i połączyć poprzednie 200 μl w probówkach do mikromiareczkowania o pojemności 1,2 ml. Uzyskuje się całkowitą objętość 300 μl barwionych komórek.
6. Analiza cytometryczna przepływowa
- Używając konwencjonalnych trzech laserów (fioletowego, niebieskiego i czerwonego lasera), unikaj barwników PE, PerCP-Cy5.5, BV510 i PI ze względu na znaczne rozlanie się niezwykle jasnych cząstek fluorescencyjnych AF488. Użyj czwartego (żółtego) lasera, aby zoptymalizować ten test, ponieważ pozwala on na zastosowanie przeciwciał znakowanych PE i PI (w kanale mCherry zamiast kanału PerCP-Cy5.5) (Figura 2).
nuta: Jeśli żółty laser nie jest dostępny, użyj barwnika wykluczającego martwe komórki w innym kanale.
- Bramka na komórkach ujemnych PI (PI-), aby wykluczyć martwe komórki (Figura 2B).
- Po wykluczeniu martwych komórek, bramka na komórkach dodatnich CD11b (CD11b +), obejmie to wszystkie komórki szpikowe (Figura 2C).
- W populacji CD11b+, brama na Ly6C-/Ly6G- w celu wykluczenia neutrofili (CD11b+/Ly6G+) i monocytów (CD11b+/Ly6C+; Rysunek 2D). Po bramkowaniu na mikrogleju (tutaj zdefiniowanym jako CD11b+/Ly6C-/Ly6G- dla uproszczenia) powinny być widoczne dwie wyraźne populacje; jeden ujemny i jeden dodatni dla cząstek znakowanych fluorescencyjnie. Komórki fagocytarne będą pobierać cząstki i dlatego są AF488+ (Figura 2E).
nuta: Populacje Ly6C dodatnie lub Ly6G mogą być również analizowane w celu zmierzenia wychwytu cząstek przy użyciu tego podejścia do barwienia. Odsetek komórek fagocytarnych CD11b + dobrze koreluje z odsetkiem mikrogleju fagocytarnego (Figura 2F). Dla badaczy bez doświadczenia w cytometrii przepływowej można przeprowadzić prostszą analizę z samym barwieniem CD11b, choć będzie to obejmować neutrofile fagocytarne i monocyty, a także mikroglej. W tej populacji CD11b+/Ly6C-/Ly6G- komórki te są > 99% mikrogleju, co oceniano na podstawie barwienia markerami F4/80 i CX3CR1; Te markery można dodawać, ale nie są one konieczne w naszych rękach.
