$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
UWAGA: Ten protokół został przetestowany na świeżo lub zamrożonych izolowanych komórkach krwi obwodowej i krwi pełnej.
1. Barwienie komórek
UWAGA: Wybór par fluorochromów praktycznie bez nakładania się widm jest ważny dla zmniejszenia rozprzestrzeniania się danych z powodu dużego rozlewania się fluorochromu w innym detektorze fluorochromu. Aby osiągnąć optymalną identyfikację wszystkich podzbiorów komórek, należy zastosować fluorochromy o wysokiej wydajności kwantowej, takie jak pary przeciwciał PE-BV421 i PE-APC.
- Barwienie świeżego i mrożonego PBMC
- Przenieś 100 μl PBMC (1 x 106 komórek) na 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery V.
nuta: Z podobnymi wynikami można użyć dowolnej liczby komórek mniejszej niż 1 x 106.
- Wirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodać do każdej studzienki 100 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej żywy/martwy barwnik, który reaguje z wolną aminą na białkach przez 10 minut, aby oznaczyć martwe komórki.
- Przygotować dla każdej próbki 30 μl mieszaniny zawierającej wszystkie przeciwciała (anty-CD3. -CD56, TCRγδ we fluorochromie A i anty-CD4, CD8, CD19, CD14 we fluorochromie B). Stężenia przeciwciał podano w tabelach 1 i 2. Na tym etapie można również dodać miareczkowane przeciwciała przeciwko różnym cząsteczkom docelowym i w różnych fluorochromach (np. Tabela 3).
nuta: Stężenie przeciwciał może się różnić w zależności od producenta i numeru partii. Dlatego należy przeprowadzić wstępne testy, aby uzyskać optymalny sygnał. PBS, PBS/0,5% albumina surowicy bydlęcej (BSA), PBS/0,2% azydek sodu lub PBS/0,5% BSA/0,1% azydek sodu stosowano z podobnymi wynikami do rozcieńczonych przeciwciał. Komórki można również barwić w objętościach innych niż 30 μl, aby łatwo zintegrować tę metodologię z już istniejącymi protokołami barwienia.
- Wirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zasysać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Dodaj koktajl przeciwciał do każdej studzienki i ostrożnie zawijaj ponownie, nie wytwarzając pęcherzyków. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
nuta: Możliwe jest barwienie próbek w temperaturze 4 °C z podobnymi wynikami.
- Dodać 150 μl buforu barwiącego i odwirować przy 350 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej i ostrożnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl PBS i uzyskać dane na cytometrze przepływowym. W przypadku zmiany objętości barwienia należy zapewnić co najmniej 20-krotne rozcieńczenie oryginalnej mieszanki przeciwciał użytej do przepłukania nadmiaru przeciwciał.
nuta: Wybarwione komórki można utrwalić w PBS/2% paraformaldehydzie, przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie pozyskać na cytometrze przepływowym następnego dnia.
ostrożność: Paraformaldehyd jest szkodliwy w przypadku połknięcia i może powodować podrażnienie skóry
2. Miareczkowanie przeciwciał
UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał jest najbardziej krytycznym krokiem do uzyskania wysokiej jakości, powtarzalnych danych. Miareczkowanie anty-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 i -TCR γδ odbywa się zgodnie ze standardową procedurą, w której stężenie przeciwciała do optymalnego oddzielenia pików dodatnich i ujemnych uzyskuje się na podstawie maksymalnego wskaźnika barwienia. Należy wybrać rozcieńczenia w momencie piku lub bliżej piku po stronie rosnącej krzywej indeksu barwienia (rysunek 1A-C). Przeciwciało anty-CD4 jest miareczkowane w celu umieszczenia szczytu populacji CD4 dodatniego między pojedynczymi populacjami dodatnimi CD3 a limfocytami T CD3 + / CD8 +, bliżej sygnału pojedynczego dodatniego CD3, aby lepiej rozróżnić populacje CD8dim (limfocyty T CD8 + γδ i limfocyty T NK). Na tej samej linii miareczkowanie CD56 ma na celu umieszczenie komórek NK CD56 + między populacją CD3 + a CD3-.
- Maksymalna krzywa indeksu plam
UWAGA: Miareczkowanie anty-CD3, -CD8, -CD14, -CD19 i -TCR γδ odbywa się zgodnie ze standardową procedurą, według której stężenie przeciwciała w celu optymalnego oddzielenia pików dodatnich i ujemnych uzyskuje się za pomocą krzywej maksymalnego wskaźnika barwienia. Jeśli do panelu zostaną dodane przeciwciała przeciwko innym markerom, należy je również miareczkować za pomocą krzywej maksymalnego wskaźnika barwienia.
- Przygotować 2-krotne rozcieńczenie przeciwciał, wypełniając 10 dołków 96-dołkowej płytki 40 μl buforu barwiącego. W pierwszym dołku zwiększ końcową objętość do 80 μl buforu barwiącego i dodaj interesujące przeciwciało o stężeniu 4-krotnym od stężenia sugerowanego przez producenta.
- Dobrze wymieszać i przenieść 40 μl do drugiego dołka. Dobrze wymieszaj i powtórz ten krok dla wszystkich innych studzienek.
- Wybarwić 10 próbek PBMC lub krwi pełnej 30 μl 10 różnych 2-krotnych rozcieńczeń przeciwciał zgodnie z protokołem opisanym wcześniej.
- Zebrać dane za pomocą cytometru przepływowego i wykreślić sygnał z każdego rozcieńczenia (rysunek 1A).
- Bramka na populacje ujemne i dodatnie dla każdego stężenia przeciwciał. Zwiększenie stężenia przeciwciał może prowadzić do wyższego tła. Dlatego odpowiednio zmień rozmiar bramki ujemnej.
- Dla każdego stężenia przeciwciał należy wyodrębnić informacje o medianie i odchyleniu standardowym dla intensywności fluorescencji w populacji ujemnej oraz medianę dla intensywności fluorescencji w populacji dodatniej. Obliczyć dla każdego stężenia przeciwciał wskaźnik barwienia za pomocą następującego wzoru: (mediana intensywności fluorescencji w populacji dodatniej — mediana intensywności fluorescencji w populacji ujemnej) ÷ (2 x odchylenie standardowe intensywności fluorescencji w populacji ujemnej) (rysunek 1B).
- Wykreślić wskaźnik barwienia w funkcji stężenia przeciwciała wyrażonego jako ułamek rozcieńczenia przeciwciała (np. rozcieńczenie 1:10 = 0,1) i określić stężenie przeciwciała o maksymalnej wartości wskaźnika barwienia (rysunek 1C).
- Miareczkowanie przeciwciał anty-CD4 i -CD56
UWAGA: Miareczkowanie przeciwciał anty-CD4 i -CD56 opiera się na poprzednim miareczkowaniu innych markerów w panelu dwufluorochromowym. W przypadku przeciwciała anty-CD4 miareczkowanie ma na celu umieszczenie sygnału anty-CD4 między podwójnym sygnałem CD8 + / CD3 + a populacją pojedynczego dodatniego CD3 (Figura 1D).
- Miareczkować przeciwciała anty-CD4 i CD56 za pomocą 2-krotnej strategii rozcieńczania, jak opisano powyżej, dodając dodatkowe stężenia pomiędzy nimi, aby dokładnie określić zakres stężeń, który pozwala oddzielić limfocyty T CD4 + i komórki NK od innych populacji komórek.
- Miareczkować przeciwciało anty-CD4, umieszczając sygnał anty-CD4 między podwójnym sygnałem CD8 + / CD3 + a populacją pojedynczego dodatniego CD3 (Figura 1D).
nuta: Należy zwrócić szczególną uwagę na wyraźne oddzielenie limfocytów T CD4 + od populacji dim CD8 +.
- Miareczkować przeciwciało anty-CD56 zgodnie ze strategią podobną do miareczkowania przeciwciał anty-CD4, umieszczając komórki NK między populacjami CD3-ujemnymi i CD3-dodatnimi.
3. Strategia bramkowania
- Zidentyfikuj populacje komórek limfocytarnych i monocytowych i usuń martwe komórki oraz większość pozostałych czerwonych krwinek z analizy.
- Wybierz całą populację zawierającą limfocyty i monocyty na podstawie obszaru rozproszenia do przodu i z boku (FSC-A vs SSC-A). Usuń agregacje komórek z analizy za pomocą wysokości rozproszenia do przodu i szerokości rozproszenia do przodu (FSC-H vs FSC-W) oraz wysokości rozproszenia bocznego w stosunku do szerokości rozrzutu bocznego (SSC-H vs SSC-W).
- Użyj markera dyskryminacji żywych/martwych, aby wykluczyć z analizy jasne dodatnie martwe komórki i resztki czerwonych krwinek. Bramka na limfocytach i monocytach w oparciu o różne profile FSC-A i SSC-A.
- Strategia bramkowania dwufluorochromowego siedmiomarkerowego populacji limfocytów.
nuta: W podgrupie CD3-dodatniej limfocyty T CD4+, CD8+ i γδ można rozdzielić za pomocą przeciwciał, które są skierowane wyłącznie przeciwko CD4, CD8 i receptorowi γδ. W porównywalny sposób, w podgrupie CD3 ujemnej, limfocyty B, komórki NK i monocyty mogą być jednoznacznie identyfikowane za pomocą przeciwciał przeciwko odpowiednio CD19, CD56 i CD14.
- Wybierz bramkę limfocytów i utwórz wykres punktowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi (ryc. 2B).
- Bramka na limfocytach T CD8 + zidentyfikowanych jako podwójnie dodatnie komórki CD3 + / CD8 + w prawym górnym rogu wykresu kropkowego (Figura 2B). Wyklucz populację dim CD8, która może zawierać komórki NKT. Bramka na limfocytach T CD4 + zidentyfikowanych jako populacja między limfocytami T CD8 + a pojedynczymi populacjami dodatnimi CD3. Bramka na limfocytach T γδ zidentyfikowanych jako wysokie komórki CD3. Podziel limfocyty T γδ na CD8 dodatnie i CD8 ujemne.
- Bramka na komórkach NK zidentyfikowana jako populacja pomiędzy komórkami CD3-dodatnimi i CD3-ujemnymi. Podziel komórki NK na CD8 dodatnie i CD8 ujemne. Bramka na komórkach B zidentyfikowanych jako CD3-ujemna populacja CD19 + w prawym dolnym rogu wykresu kropkowego.
- Wybierz bramki monocytów i utwórz wykres punktowy z jednym z dwóch fluorochromów używanych w tym protokole na każdej osi (ryc. 2C). Brama w populacji CD3-/CD14+.
Tabela 1: Panel przeciwciał używany do barwienia dwufluorochromowymi komórkami odpornościowymi PBMC (kombinacja BV421-PE).
powiedział:
)
szt.
powiedział:
powiedział:
| cel | klon | Fluorochrom | sprzedawca | koncentracja | cel |
| Płyta CD3 | UCHT1 | Zobacz materiał BV421 | Bd | 1/20 | rodowód |
| Płyta CD56 | NCAM16.2 (wersja angielska | Zobacz materiał BV421 | Bd | 1/900 | |
| TCRγδ | Klasa B1 | Zobacz materiał BV421 | bio | 1/30 | |
| Płyta CD4 | Sterownik RPA-T4 | Pe | Bd | 1/450 | |
| Płyta CD8 | Sterownik RPA-T8 | Pe | Bd | 1/20 | |
| Płyta CD14 | Zobacz materiał M5E2 | Pe | Bd | 1/15 | |
| Płyta CD19 | HIB19 | Pe | Bd | 1/300 | |
| Martwe komórki | | L/D Niebieski | Lt | 1/300 | Dyskryminacja żywych/martwych |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies |
Tabela 2: Panel przeciwciał używany do barwienia dwufluorochromowymi komórkami odpornościowymi PBMC (kombinacja APC-PE).
powiedział:
)
powiedział:
powiedział:
| cel | klon | Fluorochrom | sprzedawca | koncentracja | cel |
| Płyta CD3 | UCHT1 | Apc | Bd | 1/20 | rodowód |
| Płyta CD56 | NCAM16.2 (wersja angielska | Apc | Bd | 1/60 | |
| TCRγδ | Klasa B1 | Apc | bio | 1/30 | |
| Płyta CD4 | Sterownik RPA-T4 | Pe | Bd | 1/450 | |
| Płyta CD8 | Sterownik RPA-T8 | Pe | Bd | 1/20 | |
| Płyta CD14 | Zobacz materiał M5E2 | Pe | Bd | 1/15 | |
| Płyta CD19 | HIB19 | Pe | Bd | 1/300 | |
| Martwe komórki | | L/D Niebieski | Lt | 1/300 | Dyskryminacja żywych/martwych |
| BD = BD Biosciences, Bio = BioLegend, LT = Life Technologies |
Tabela 3: Panel przeciwciał używany do barwienia zamrożonego PBMC od pacjenta ze szpiczakiem mnogim.
powiedział:
)
szt.
powiedział:
powiedział:
)
powiedział:
)
)
powiedział:
szt.
powiedział:
| cel | klon | Fluorochrom | katalog | sprzedawca | koncentracja | cel |
| Płyta CD3 | UCHT1 | Zobacz materiał BV421 | 562426 | Bd | 1/20 | rodowód |
| Płyta CD56 | NCAM16.2 (wersja angielska | Zobacz materiał BV421 | 562751 | Bd | 1/900 | |
| TCRγδ | Klasa B1 | Zobacz materiał BV421 | 331217 | bio | 1/30 | |
| Płyta CD4 | Sterownik RPA-T4 | Pe | 555347 | Bd | 1/450 | |
| Płyta CD8 | Sterownik RPA-T8 | Pe | 555367 | Bd | 1/20 | |
| Płyta CD14 | Zobacz materiał M5E2 | Pe | 555398 | Bd | 1/15 | |
| Płyta CD19 | HIB19 | Pe | 555413 | Bd | 1/300 | |
| CCR7 (Klasa przemysłowa | Zobacz materiał G043H7 | AF647 | 353217 | bio | 1/30 | różniczkowanie |
| Płyta CD45RA | HI100 | APC-H7 | 560674 | Bd | 1/60 | |
| CCR4 (Zobacz materiał CCR4 | Zobacz materiał 1G1 | PE-CY7 | 561034 | Bd | 1/60 | Th podzbiory |
| CCR6 (Zobacz materiał CCR6 | G034-E3 | Zobacz materiał BV605 | 353419 | bio | 1/30 | |
| CXCR3 | 1C6/CXCR3 | AF488 | Numer katalogowy: 561730 | Bd | 1/30 | |
| Płyta CD57 | NK-1 | PE-CF594 | 562488 | Bd | 1/900 | Aktywacja/wyczerpanie |
| HLA-DR | Zobacz materiał G46-6 | Zobacz materiał BV510 | 563083 | Bd | 1/30 | |
| Płyta CD16 | 3G8 | Zobacz materiał BUV395 | 563784 | Bd | 1/30 | NK, aktywacja monocytów |
| Martwe komórki | L/D Niebieski | L-23105 | Lt | 1/300 | Dyskryminacja żywych/martwych |
