Test kodów kreskowych do charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej komórek odpornościowych

Abstract

Źródło: Baxter, R. M., et al. Jednokomórkowa analiza immunofenotypu i produkcji cytokin w obwodowej krwi pełnej za pomocą cytometrii masowej. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film przedstawia metodę proteomiczną pojedynczej komórki, która wykorzystuje przeciwciała sprzężone z metalami ciężkimi do odrębnego kodowania kreskowego komórek. Następnie stosuje się barwienie immunologiczne i cytometrię masową w celu oceny zmian immunologicznych fenotypowych i funkcjonalnych w ludzkich komórkach odpornościowych pochodzących z krwi pełnej.

Protocol

1. Kod kreskowy lizowanych/utrwalonych komórek krwi

1. Rozmrażać zlizowane/utrwalone próbki komórek z magazynu w temperaturze -80 °C powoli na lodzie; Za pomocą tego systemu można oznaczyć maksymalnie 20 próbek unikalnymi kodami kreskowymi i połączyć je ze sobą. Rozcieńczyć 10-krotny bufor trwałej ondulacji kodów kreskowych w stosunku 1:10 za pomocą PBS; zrobić wystarczającą ilość buforu dla ~ 3 ml na próbkę.
2. Napełnij jedno niesterylne koryto CSM, a drugie buforem perm 1X do kodów kreskowych. Dodać 1 ml lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszać pipetą i przenieść do odpowiednich wstępnie znakowanych probówek....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ruxolitinib	Santa Cruz	SC-364729A	Zawartość magazynowa: 10 mM; Stężenie końcowe: 5 μM
R848	Invivogen	tlrl-r848-5	Stężenie magazynowe: 1 μg/μL; Stężenie końcowe: 1 μg/ml
LPS-EK	Invivogen	tlrl-eklps	Stężenie magazynowe: 1 μg/μL; Stężenie końcowe: 0,1 μg/ml
Sterylny PBS	Lonza	17-516F
Lyse/Fix Buffer	BD biosciences	558049	Stężenie magazynowe: 5X; Stężenie końcowe: 1X (rozcieńczyć w ddH2O)
BD Bufor do trwałej ondulacji/płukania Phosflow I	BD nauki biologiczne	557885	Zawartość magazynowa: 10X; Końcowe Conc: 1:10 (rozcieńczyć w ddH2O)
RPMI	Gibco	21870-076
Azydek sodu (NaN3)	Sigma-Aldrich	S-8032	Zawartość magazynowa:>99,9%; Końcowe stężenie: 0,0002
Inhibitor transportu białek (PTI)	eNauki biologiczne	00-4980-93	Zawartość magazynowa: 500X; Końcowe potwierdzenie: 1X
Interkalator DNA	Fluidigm	201192B	Stężenie magazynowe: 500 μM; Stężenie końcowe: 0,1 μM
Bufor Perm kodów kreskowych MaxPar	Fluidigm	201057	Zawartość magazynowa: 10X; Końcowe stwierdzenie: 1X
Zestaw kodów kreskowych Pd 20-plex	Fluidigm	S0014	Stan magazynowy: nie dotyczy; Końcowe potwierdzenie: n/a
Przeciwciała stosowane w cytometrii masowej
Znaczniki powierzchni
CD1c	Legenda biologiczna	L161	Masa: 161
CD3	BD	UCHT1	Masa: 144
CD4	Biolegend	SK3	Masa: 174
CD7	BD	M-T701	Masa: 149
CD8	Legenda biologiczna	SK1	Masa: 142
CD11b	Fluidigm	ICRF44	Masa: 209
CD11c	BD	B-ly6	Masa: 152
CD15	BD	HI98	Masa: 115
CD14	Legenda biologiczna	M5E2	Masa: 154
CD16	eBioscience/Thermo	B73.1	Masa: 165
CD19	Santa Cruz	SJ25C1	Masa: 163
CD21	Legenda biologiczna	Bu32	Masa: 141
CD27	BD	L128	Masa: 155
CD38	Fluidigm	TRAFIENIE2	Masa: 172
CD45 razem	Legenda biologiczna	HI30	Masa: 89
CD45RA	Legenda biologiczna	HI100	Masa: 153
CD56	Miltenyi	REA196	Masa: 168
CD66	BD	B1.1/CD66	Masa: 113
CD86	Fluidigm	IT2.2	Masa: 150
CD123	Fluidigm	6H6	Masa: 143
CD278/ICOS	Legenda biologiczna	C398.4A	Masa: 156
CD179/PD1	Legenda biologiczna	EH12.2H7	Masa: 162
IgD	Legenda biologiczna	IA6-2	Masa: 146
IgM	Legenda biologiczna	MHM-88	Masa: 151
CXCR5	BD	RF8B2	Masa: 173
HLADR	Legenda biologiczna	L243	Masa: 167
Cytokiny
IL-1α	Legenda biologiczna	364-3B3-14	Masa: 147
IL-1β	Legenda biologiczna	H1b-98	Masa: 169
IL-1RA	Santa Cruz	AS17	Masa: 157
IL-6	Legenda biologiczna	MQ2-13A5	Masa: 164
IL-8	BD	E8N1	Masa: 160
IL-12/IL-23p40	Legenda biologiczna	C8.6	Masa: 171
Ił-17A	Legenda biologiczna	BL168	Masa: 148
IL23p19	eBioscience/Thermo	23dcdp	Masa: 176
MIP1β	BD	D21-1351	Masa: 158
MCP1	BD	5D3-F7	Masa: 170
IFNα	Miltenyi	LT27:295	Masa: 175
IFNγ	Legenda biologiczna	4S. B3	Masa: 165
PTEN	BD	A2B1	Masa: 159
TNFα	Legenda biologiczna	Mab11	Masa: 166
Uwaga: Jeśli producent jest podany jako Fluidigm, to przeciwciało zostało zakupione od Fluidigm z metalem wstępnie sprzężonym. Jeśli producent jest określony jako inny niż Fluidigm, przeciwciało to zostało samosprzężone przy użyciu zestawu MaxPar Multi-Metal Labeling Kit (Fluidigm Cat: 201300) zgodnie z protokołem producenta.