$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kod kreskowy lizowanych/utrwalonych komórek krwi
- Rozmrażać zlizowane/utrwalone próbki komórek z magazynu w temperaturze -80 °C powoli na lodzie; Za pomocą tego systemu można oznaczyć maksymalnie 20 próbek unikalnymi kodami kreskowymi i połączyć je ze sobą. Rozcieńczyć 10-krotny bufor trwałej ondulacji kodów kreskowych w stosunku 1:10 za pomocą PBS; zrobić wystarczającą ilość buforu dla ~ 3 ml na próbkę.
- Napełnij jedno niesterylne koryto CSM, a drugie buforem perm 1X do kodów kreskowych. Dodać 1 ml lodowatego CSM do świeżo rozmrożonych próbek, dokładnie wymieszać pipetą i przenieść do odpowiednich wstępnie znakowanych probówek z polipropylenu.
- Pobrać próbkę o objętości 10 μl, aby policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru. Normalizuj liczbę komórek do 1,5–2 x 106 komórek na próbkę w każdej probówce zbiorczej: usuń i wyrzuć objętość nadmiaru komórek powyżej 2 x 106 komórek.
- Odwirować komórki przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych za pomocą pipety wielokanałowej i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant.
- Ułóż probówki zbiorcze na stojaku w tej samej kolejności, jak wskazano na kluczu kodu kreskowego, tak aby próbka była zgodna z jej kodem kreskowym. Dodaj 800 μl 1X bufor do trwałej ondulacji z kodowaniem kreskowym za pomocą pipety wielokanałowej do wszystkich próbek w probówkach zbiorczych bez dotykania osadu komórkowego końcówkami pipet (no mixing), aby zmniejszyć utratę komórek. Odłóż na bok stojak z rurkami klastrowymi.
- Usuń paski probówek 20-plex Pd Barcoding Kit z -20 °C i rozmrozić w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 μl bufora trwałej ondulacji 1X do kodów kreskowych, dokładnie wymieszaj i przenieś 120 μl zawieszonej mieszanki kodów kreskowych do odpowiednich próbek komórek w probówkach zbiorczych.
- Dokładnie wymieszać za pomocą pipety wielokanałowej, aby nie doszło do zanieczyszczenia krzyżowego między poszczególnymi próbkami oznaczonymi kodem kreskowym. Inkubować probówki zbiorcze przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby kody kreskowe mogły oznaczyć komórki.
- Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml CSM.
- Ponownie odwirować i ponownie zawiesić w CSM.
Uwaga: Każda próbka jest teraz oznaczona unikalnym kodem kreskowym, a próbki są gotowe do łączenia.
- Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Za pomocą jednej pipety i tej samej końcówki przenieś wszystkie granulki komórek w ~70–80 μl resztkowej objętości do jednej rurki polistyrenowej. Czy NOT wysuwa końcówkę pipety; Odłóż na bok pojedynczą pipetę z tą końcówką.
- Za pomocą wielokanałowej pipety i nowych końcówek dodaj ~100 μl CSM do każdej oryginalnej probówki aparatu udojowego, aby zmaksymalizować regenerację komórek. Za pomocą pojedynczej pipety z odłożoną na bok końcówką przenieś wszystkie granulki komórek w ~100 μl pozostałej objętości do tej samej probówki z polistyrenu.
- Dodaj CSM, aby uzupełnić rurkę z polistyrenu (~ 3 ml). Policz i zapisz numer komórki w zbiorczym zestawie kodów kreskowych. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant. Przystąp do barwienia próbek z kodami kreskowymi tego samego dnia.
Uwaga: Normalne jest oczekiwanie ~20–30% utraty komórek w procesie kodowania kreskowego.
2. Barwienie lizanych/utrwalonych komórek krwi z kodami kreskowymi i przygotowanie do analizy na cytometrze masowym
Uwaga: Każdy 1X miano przeciwciała barwiącego (1 μL przeciwciała na 100 μL reakcji barwienia) może zwykle zabarwić 3-4 x 106 komórek. Dlatego, gdy wszystkie próbki z kodami kreskowymi zostaną zebrane w jednej probówce, ilość przeciwciał musi zostać zwiększona w górę. Jeśli 20 próbek z kodami kreskowymi to 30 x 106 komórek, a każde miano 1X może zabarwić 3–4 x 106, próbka oznaczona kodem kreskowym wymaga tylko 10-krotnego miana, w przeciwieństwie do barwienia każdej próbki indywidualnie, co wymagałoby 20-krotnej ilości przeciwciał (1X na pojedynczą probówkę). Stężenie przeciwciała do liczby komórek powinno być starannie miareczkowane dla każdego pojedynczego koktajlu przeciwciał (nie omówione tutaj).
- Wybarwić komórki za pomocą przeciwciał (Tabela materiałów) do barwienia powierzchni i indukcji cytokin.
- Przygotuj koktajl barwienia powierzchni, obliczając ilość do dodania i uwzględniając błąd pipetowania (i.e., w przypadku barwienia 20 próbek z kodami kreskowymi 2 x 106 komórek w każdej próbce, wymagane jest 10-krotne barwienie mianem; do obliczeń końcowej objętości należy skompensować błąd pipetowania, tworząc 10,5-krotny końcowy roztwór barwiący).
- Dodaj 10-krotnie większą objętość barwienia powierzchni do osadu komórek z kodem kreskowym. Aby zmniejszyć utratę komórek, za pomocą tej samej końcówki wymieszaj i zmierz objętość plam powierzchniowych i granulek komórek.
- W oparciu o objętość komórek i koktajl barwiący, dodaj CSM do końcowej objętości barwienia wynoszącej 50 μl na liczbę próbek komórek (i.e., jeśli używasz zestawu 20 próbek, 50 μL X 20 = 1 ml). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.
- Podczas inkubacji barwienia powierzchniowego przygotuj bufor do trwałej ondulacji/płukania (Tabela materiałów), rozcieńczając w stosunku 1:10 przefiltrowanym ddH2O. Przygotuj objętości 2 ml do przepuszczania i 5 ml do przemywania. Przechowywać w temperaturze 4 °C lub na lodzie.
- Uzupełnić probówkę do barwienia powierzchni CSM i odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odessać supernatant. Ponownie zawiesić próbkę oznaczoną kodem kreskowym w 2 ml buforu Perm/Wash o temperaturze 4 °C i rozcieńczeniu 1:10. Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20–30 minut, aby w pełni przepuszczalność komórek.
- Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant.
- W przypadku barwienia wewnątrzkomórkowego postępuj zgodnie z podobnymi etapami barwienia (jak w przypadku barwienia powierzchni). Należy jednak użyć buforu do trwałej ondulacji/płukania w rozcieńczeniu 4 °C, 1:10 zamiast CSM, aby uzyskać całkowitą objętość barwienia, tak aby komórki pozostały w środowisku przepuszczalnym przez cały czas barwienia wewnątrzkomórkowego.
- Dodać wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał do barwionego powierzchniowo i przepuszczalnego osadu komórkowego (kroki 2.1.2–2.1.7). Doprowadzić całkowitą objętość barwienia do 50 μl na liczbę próbek komórek. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Mieszać próbkę co 15 minut, aby zapewnić równomierne barwienie.
- Podczas barwienia wewnątrzkomórkowego należy przygotować roztwór interkalatora: 900 μL przefiltrowanego PBS + 100 μL przefiltrowanego 16% PFA (końcowe stężenie 1,6% PFA) + 0,2 μL 500 uM barwnika interkalatorowego (Tabela materiałów).
- Uzupełnij granulat komórkowy + wewnątrzkomórkowy koktajl przeciwciał zimnym buforem 1:10 Perm/Wash.
- Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Uzupełnij rurkę do barwienia CSM. Policz i zapisz numer komórki. Odwirować przy 600 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut i odessać supernatant. Zawiesić komórki w 1 ml roztworu interkalatora z kroku 4.9. Inkubować przez co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej w celu pełnej interkalacji lub przez noc w temperaturze 4 °C (próbki w roztworze interkalatora mogą pozostawać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia przed poddaniem ich działaniu w przyrządzie do cytometrii masowej).
- Przygotuj komórki do przyrządu do cytometrii masowej.
- Uzupełnić probówkę 3 ml przefiltrowanego ddH2O i odwirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml przefiltrowanego ddH2O. Przepuścić tę zawiesinę przez filtr 100 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia lub zagięcia, które mogłyby potencjalnie zatkać przyrząd do cytometrii masowej.
- Policz i zapisz liczbę komórek po filtracji. Wirować przy 600 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C
- Przygotuj roztwór kulki kalibracyjnej (Tabela materiałów), rozcieńczając go w stosunku 1:10 w przefiltrowanym ddH2O.
- Ponownie zawiesić wybarwione komórki w wymaganej objętości rozcieńczonego roztworu kulek kalibracyjnych w stosunku 1:10, aby uzyskać stężenie komórek ~1 x 106 komórek/ml.
Uwaga: Dla CyTOF1 przy 45 μL/min zalecane optimum to 5 x 105 komórek/ml; dla Heliosa przy 30 μL/min, 7,5 x 105 komórek/ml.
- Kontynuuj badanie próbki na przyrządzie do cytometrii masowej.