Wykorzystanie sond napięcia opartych na DNA do oceny sił receptorowych wywieranych przez komórki odpornościowe

Streszczenie

Źródło: Ma, R. et al., Sondy napięcia DNA do mapowania przejściowych sił receptora pikoningtonu przez komórki odpornościowe. J. Vis. Exp.(2021)

Film demonstruje metodę oceny sił receptorów wywieranych przez komórki odpornościowe za pomocą nanocząsteczek złota zakotwiczonych w glikolu polietylenowym i sond napinających spinki do włosów DNA. Interakcje limfocytów T CD8-dodatnich powodują rozwijanie sondy, emitując fluorescencję, podczas gdy nici blokujące podtrzymują sygnał do ilościowego określania sił wywieranych przez komórki odpornościowe.

Protokół

1. Preparat oligonukleotydowy

1. Rozpuść nić liganda kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) w wodzie (rezystywność 18,2 MΩ, stosowana w całym protokole). Zwiruj i odwiruj roztwór za pomocą wirówki stołowej. Dostosuj objętość wody tak, aby końcowe stężenie wynosiło 1 mM. Sprawdzić poprawność stężenia za pomocą spektrofotometru nanokropli do pomiaru absorbancji przy 260 nm i określić końcowe stężenie na podstawie współczynnika ekstynkcji oligonukleotydu.
   nuta: Nić liganda ma modyfikację na każdym końcu, 5' aminy i 3' biotyny, aby sprzęgnąć się z fluoroforem i przedstawić biotynylowany ligand. Grupa aminowa w nici liganda musi być sprzężona z fluoroforem. Barwnik Cy3B jest używany do tej koniugacji ze względu na jego wysoką jasność i fotostabilność, ale nie jest zwykle oferowany komercyjnie i wymaga koniugacji we własnym zakresie. W związku z tym w poniższej sekcji opisano koniugację między aminami a barwnikami estrowymi N-hydroksysukcynimidu (NHS). Dla użytkowników końcowych, którzy nie mają dostępu do urządzeń lub zasobów do modyfikacji kwasów nukleinowych, zmodyfikowane kwasy nukleinowe można zamiast tego kupić od niestandardowych dostawców syntezy DNA, którzy oferują jasne i fotostabilne barwniki, takie jak rodzina barwników Alexa i Atto.
2. Przygotować 10 x roztwory soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i 1 M wodorowęglanu sodu (NaHCO₃). Zmieszać 10 μl 1 mM roztworu nici ligandu aminowego (10 nmol) z 10 μl 10 x PBS, 10 μl 1 M_NaHCO3 i 60 μL_H2O. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić 50 μg N-hydroksysukcynimidu Cy3B (estru NHS) w 10 μl dimetylosulfotlenku (DMSO) i dodać do mieszaniny w celu uzyskania całkowitej objętości reakcyjnej 100 μL. Dodać ester Cy3B NHS ostatni. Pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 1 godzinę lub 4 °C przez noc.
3. Przygotuj nić blokującą Atto647N, koniugując nić blokującą aminę z estrem Atto647N NHS. Przygotować 10x PBS i 1 M roztwór NaHCO₃. Zmieszać 10 μl 1 mM roztworu nici blokującej aminy (10 nmol) z 10 μl 10 PBS, 10 μL 1 M_NaHCO3 i 60 μL H₂O. Rozpuść 50 μg estru Atto647N NHS w 10 μL DMSO bezpośrednio przed użyciem i dodaj do mieszaniny na całkowitą objętość reakcyjną 100 μL. Na końcu dodać ester Atto647N NHS. Pozostawić do reakcji w temperaturze pokojowej na 1 godzinę lub 4 °C przez noc.
4. Po reakcjach usuń produkty uboczne, nadmiar barwnika i sole za pomocą filtracji żelu odsalającego P2. Rozcieńczyć mieszaninę reakcyjną_H2Odo całkowitej objętości 300 μl, która jest odpowiednia dla kolejnego etapu oczyszczania metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Dodaj 650 μl uwodnionego żelu P2 do urządzenia odśrodkowego i wiruj do 18 000 x g przez 1 minutę. Usunąć ciecz z dolnej części urządzenia, dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny zawierającej żel P2, odwirować przy 18 000 x g przez 1 minutę i zebrać mieszaninę reakcyjną na dnie urządzenia.
   nuta: Żel P2 należy nawodnić co najmniej 4 godziny przed użyciem za pomocą_H2O.
5. Oczyścić odsoloną mieszaninę reakcyjną za pomocą HPLC przy użyciu kolumny C18 przeznaczonej do oczyszczania oligonukleotydów, rozpuszczalnikiem A: 0,1 M octan trietyloamoniu (TEAA) w_H2Oi B: acetonitryl (ACN) jako fazę ruchomą dla elucji o liniowym gradiencie 10-100% B przez 50 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Wstrzyknąć odsoloną mieszaninę reakcyjną do HPLC z odwróconymi fazami za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 500 μl w celu oczyszczenia. Zebrać produkt, który ma pik absorbancji dla kwasu dezoksyrybonukleinowego, DNA (260 nm) i pik absorbancji dla fluoroforu (560 nm dla Cy3B i 647 nm dla Atto647N) i wysuszyć go w próżniowym koncentratorze odśrodkowym przez noc (patrz rysunek 1A).
6. Wysuszony produkt z oligobarwnikiem należy rozpuścić w 100 μl wody. Określić stężenie nici liganda Cy3B i nici blokującej Atto647N za pomocą spektrofotometru nanokroplowego. Upewnij się, że stosunek etykietowania barwnika jest zbliżony do 1:1. W razie potrzeby należy skorygować absorbancję barwnika wynoszącą 260 nm przy określaniu stężenia oligonukleotydów.
7. Zwalidować oczyszczony produkt za pomocą spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycowo i czasem przelotu (MALDI-TOF-MS) przy użyciu aldehydu 3-hydroksypropionowego (3-HPA) jako substratu w 50% ACN/H₂O z 0,1% kwasem trifluoroctowym (TFA) i 5 mg/ml cytrynianu amonu przy użyciu 0,5 μl produktu w temperaturze 1-5 μM do przygotowania próbki MALDI-TOF-MS. Przykładowe widmo masowe można znaleźć na rysunku 1B.
8. Rozpuścić pasmo spinki do włosów i pasmo kotwiczące hartownicy w wodzie i upewnić się, że stężenie roztworów podstawowych wynosi od 50 do 100 μM.
   nuta: Pasmo spinki do włosów jest niemodyfikowane i może być bezpośrednio syntetyzowane na zamówienie od dostawcy. Pasmo kotwiczne ma tiolową grupę kotwiącą i wygaszacz BHQ2 i może być bezpośrednio syntetyzowane na zamówienie od dostawcy.
9. Podwielokrotność wszystkich oligonukleotydów. W przypadku krótkotrwałego stosowania i przechowywania oligonukleotydy należy przechowywać w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy je zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym momencie wszystkie oligonukleotydy są gotowe do złożenia sondy napinającej DNA.
   nuta: Powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania nie są problematyczne dla oligonukleotydów.

2. Przygotowanie powierzchni

UWAGA: Przygotowanie substratów sondy DNA do napinania spinek do włosów trwa dwa dni. Sonda napinająca spinkę do włosów DNA zostanie funkcjonalizowana na szklanych szkiełkach nakrywkowych.

1. Dzień 1
   1. Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm na stojaku z politetrafluoroetylenu w zlewce o pojemności 50 ml. Każdy stojak może pomieścić do 8 szkiełek nakrywkowych. Opłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je trzykrotnie w wodzie.
   2. Dodać 40 ml roztworu etanolu zmieszanego z wodą w stosunku 1:1 (v:v) do zlewki zawierającej ruszt i szkiełka nakrywkowe i uszczelnić zlewkę folią parafinową.
   3. Sonikować zlewkę przez 15 minut w myjce ultradźwiękowej (częstotliwość robocza 35 KHz) w celu oczyszczenia szkiełek nakrywkowych. Po sonikacji wylać płyn i przepłukać zlewkę ze stojakiem i szkiełkami nakrywkowymi w niej wodą co najmniej 6 razy, aby usunąć resztki rozpuszczalnika organicznego.
   4. Przygotuj świeży roztwór piranii, mieszając kwas siarkowy i nadtlenek wodoru w stosunku 3:1. Aby przygotować 40 ml roztworu piranii, najpierw dodaj 30 ml kwasu siarkowego do czystej zlewki o pojemności 50 ml, a następnie powoli dodaj 10 ml nadtlenku wodoru,_H2O2. Roztwór piranii szybko się nagrzewa i bulgocze po dodaniu_H2O2. Delikatnie wymieszaj piranię za pomocą końcówki szklanej pipety.
   5. Następnie przenieś stojak, w którym znajdują się szkiełka nakrywkowe, do zlewki zawierającej delikatnie wymieszany roztwór piranii do wytrawiania (ryc. 2A). Pozwól roztworowi piranii hydroksylować i czyść szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po wytrawieniu piranii przenieś stojak za pomocą pęsety stalowej lub politetrafluoroetylenowej do czystej zlewki o pojemności 50 ml z wodą i ponownie spłucz wodą co najmniej 6 razy.
      ostrożność: Duże ilości substancji organicznych mogą gwałtownie reagować z roztworem piranii i powodować eksplozję. Bądź ostrożny i zawsze pracuj z roztworem Piranha w dygestorium. Upewnij się, że nosisz fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary ochronne. Nigdy nie przechowuj świeżego roztworu Piranha w szczelnie zamkniętym pojemniku.
      nuta: Stosunek nadtlenku wodoru do kwasu siarkowego powinien być utrzymywany na poziomie poniżej 1:2 (v:v) i nigdy nie powinien przekraczać 1:1. Zanurzając stojak z szkiełkami nakrywkowymi w roztworze Piranha, umieszczaj je w roztworze powoli i ostrożnie. Nie wyrzucaj roztworu bezpośrednio po wytrawieniu, ponieważ jest on nadal aktywny i gorący. Pozostaw go w zlewce na noc przed wlaniem go do pojemnika na odpady kwasowe.
   6. Zanurz stojak z szkiełkami nakrywkowymi w zlewce o pojemności 50 ml z 40 ml etanolu, aby usunąć wodę. Wyrzuć etanol i powtórz 3 razy, aby upewnić się, że woda została usunięta.
   7. Następnie zanurzyć stojak w 3% aminopropylotrietoksysilanie (APTES) (v/v) w 40 ml etanolu, aby reagować z -OH na szkiełkach nakrywkowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (rysunek 2B).
      nuta: Etanol można zastąpić acetonem.
   8. Spłucz powierzchnie 6 razy, zanurzając je w 40 ml etanolu, a następnie wysusz w suszarce w temperaturze 80 °C przez 20 minut. Po schłodzeniu wysuszone szkiełka nakrywkowe modyfikowane aminami należy przechowywać w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości (do 6 miesięcy).
   9. Przykryj dolną wewnętrzną stronę plastikowych szalek Petriego o średnicy 10 cm folią parafinową. Folia parafinowa zapobiega przesuwaniu się szkiełek nakrywkowych wewnątrz szalki Petriego i pomaga utrzymać roztwór do kolejnych etapów funkcjonalizacji na szkiełkach nakrywkowych. Umieścić schłodzone szkiełka nakrywkowe modyfikowane aminami na szalkach Petriego. Strona, która ma być funkcjonalizowana, powinna być skierowana do góry.
   10. Aby zmodyfikować grupy aminowe na szkiełkach nakrywkowych, dodaj 300 μl 0,5% w/v poli(glikolu etylenowego) (PEG) NHS (LA-PEG-SC) i 2,5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) w 0,1 M NaHCO₃ na każde szkiełko nakrywkowe i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (rysunek 2C). Na każde szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm należy odważyć 1,5 mg LA-PEG-SC i 7,5 mg mPEG-SC. Odczynniki NHS należy rozpuścić bezpośrednio przed dodaniem ich do powierzchni, ponieważ mają one krótki okres półtrwania (~10 min) w roztworze wodnym o temperaturze pokojowej. Po reakcji spłukać powierzchnie 3 razy wodą.
       nuta: Reakcję NHS można przeprowadzić w temperaturze 4 °C przez noc. Odczynniki NHS mają dłuższy okres półtrwania przed hydrolizą w temperaturze 4 °C, czyli około 4-6 godzin. Spowoduje to trzydniową procedurę przygotowania powierzchni.
   11. Dodać 100 μl 0,1 M wodorowęglanu sodu, NaHCO₃ zawierającego 1 mg/ml octanu sulfo-NHS do zestawu szkiełek nakrywkowych typu "sandwich" (dwa szkiełka nakrywkowe skierowane do siebie z buforem reakcyjnym pomiędzy nimi). Pozostawić pasywację na co najmniej 30 minut. Aby zaoszczędzić odczynnik, ten krok można wykonać za pomocą 50 μl 1 mg/ml octanu sulfo-NHS. Po pasywacji spłukać trzykrotnie wodą.
   12. Dodać 0,5 ml nanocząstek złota (AuNP, 8,8 nm, kwas garbnikowy, 0,05 mg/ml) do każdego szkiełka nakrywkowego i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 2D). Aby zaoszczędzić odczynnik, ten krok można wykonać, umieszczając również dwa szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że w systemie nie ma soli z poprzednich kroków, aby uniknąć agregacji nanocząstek złota. Nie pozostawiaj szkiełek nakrywkowych do wyschnięcia po tym kroku.
   13. Tymczasem wstępnie hybrydyzuj spinkę do włosów 4,7 pN, nić liganda Cy3B i nić kotwiczną BHQ2, które tworzą sondy napięcia DNA, konstruują w stosunku 1,1: 1: 1 w 1 M chlorku sodu (NaCl) przy 300 nM w probówce reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Wyżarzać pasma, podgrzewając roztwór do 95 °C przez 5 minut, a następnie stopniowo schładzać, zmniejszając temperaturę do 20 °C w ciągu 30 minut w termocyklerze.
   14. Szkiełka nakrywkowe spłukać wodą trzy razy po 30 minutach inkubacji z nanocząstkami złota. Dodaj dodatkową nić kotwiczną BHQ2 (z zapasu 100 μM) do wyżarzonego roztworu DNA, aby uzyskać stosunek między nicią kotwiczącą BHQ2 a nicią liganda Cy3B 10:1. W tym momencie roztwór DNA powinien zawierać 300 nM konstrukcji sondy naprężającej i 2,7 μM nici BHQ2. Dodaj 100 μl na dwa szkiełka nakrywkowe, aby przygotować "kanapkę" (rysunek 2E).
   15. Ostrożnie umieść mokrą kulkę tkanki laboratoryjnej na szalce Petriego (z dala od szkiełek nakrywkowych) i uszczelnij naczynie folią parafinową, aby zapobiec wysychaniu roztworu. Przykryj naczynie folią i inkubuj w temperaturze 4 °C przez noc.
2. Dzień 2
   1. Zmyć nadmiar sond z szkiełek nakrywkowych za pomocą 1x PBS. Sprawdź jakość powierzchni sondy napięcia DNA pod mikroskopem epifluorescencyjnym.
   2. Przygotować 40 μg/ml streptawidyny w 1x PBS i inkubować na szkiełkach nakrywkowych przez 30 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 2F). Zazwyczaj 100 μl wystarcza na szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm. Po inkubacji spłukać PBS 3 razy, aby zmyć nadmiar streptawidyny.
   3. Przygotować 40 μg/ml biotynylowanego przeciwciała/liganda w 1x PBS. Dodać 50-100 μl na kanapkę i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (ryc. 2G). Po inkubacji przepłukać PBS trzy razy, aby zmyć nadmiar biotynylowanego przeciwciała/ligandu.
   4. Ostrożnie zmontuj czyste komory obrazowania z powierzchniami. Powierzchnie mogą być łatwo pęknięte podczas dokręcania komór. Dodaj 0,5-1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) do komór obrazowania i utrzymuj je w gotowości do obrazowania z komórkami (ryc. 2H).

3. Obrazowanie sił receptorów komórkowych

1. Przygotuj komórki odpornościowe będące przedmiotem zainteresowania w HBSS w 1-2 x 10⁶ komórek/ml.
   nuta: Komórki naiwne OT-1 CD8 + są używane jako przykład w tym artykule. Oczyść naiwne limfocyty T OT-1 ^{CD8 +} ze śledziony poświęconych myszy za pomocą zestawu do izolacji mysich limfocytów T CD8 ⁺ myszy MACS z separatorem sortowania komórek aktywowanym magnetycznie (MACS) zgodnie z instrukcjami producenta. Wyizoluj i wzbogać limfocyty T CD8 ⁺, usuwając wszelkie limfocyty T inne niż CD8 +, z którymi związany jest koktajl przeciwciał zubożających magnetycznie. Ponownie zawiesić oczyszczone limfocyty T nienawątkowe OT-1 CD8 + w HBSS w dawce 2 x 10⁶ komórek/ml i przechowywać na lodzie przed użyciem.
2. Sprawdź jakość powierzchni sondy napinającej spinkę do włosów DNA pod mikroskopem fluorescencyjnym (obiektyw 100x) w celu kontroli jakości przed dodaniem ligandów lub posiewem komórek. Zobrazuj i określ ilościowo średnią intensywność tła w kanale Cy3B powierzchni sondy napinającej spinkę do włosów DNA z co najmniej 5 różnych pozycji i 3 powtórzeń. Utrzymuj spójne warunki akwizycji obrazu, aby wartość ta mogła być używana jako wiarygodny znacznik jakości powierzchni i gęstości sondy (Rysunek 3C).
   nuta: Określ ilościowo liczbę nici DNA na nanocząstkę złota i liczbę nanocząstek złota na μm² podczas pierwszych kilku etapów przygotowania powierzchni zgodnie z literaturą, które można wykorzystać jako kolejny wiarygodny marker jakości powierzchni.
3. Płytka ~ 4 x 10⁴ - 10 x 10⁴ komórki na każdej sondzie napięcia DNA funkcjonalizuje szkiełko nakrywkowe i pozwala im się przyczepić i rozprowadzać przez ~ 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Gdy komórki są umieszczane na sondach napinających spinkę do włosów DNA i zaczynają się rozprzestrzeniać, zobrazuj sygnały fluorescencyjne, które są generowane w kanale Cy3B za pomocą obiektywu 100x (Figura 2I).
5. Po tym, jak komórki zaczną wytwarzać sygnał napięcia w czasie rzeczywistym na powierzchni sondy napinania spinki DNA w kanale Cy3B, uzyskaj obrazy zarówno w kanałach Cy3B, jak i Atto647N (mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) zapewnia lepszy stosunek sygnału do szumu niż epifluorescencja). Następnie dodać nić Atto647N do komór obrazowania w końcowym stężeniu 200 nM w celu mechanicznie selektywnej hybrydyzacji.
6. Po 10 minutach inkubacji szybko i delikatnie usuń bufor zawierający fluorescencyjną nić blokującą Atto647N i zastąp go świeżymi zrównoważonymi solami Hanka. Ponownie zobrazuj oba kanały Cy3B i Atto647N i określ współczynnik korelacji Pearsona za pomocą oprogramowania Fiji.
7. W momencie zainteresowania badania należy wprowadzić niefluorescencyjną nić blokującą do komórek w komorze obrazowania, aby przechowywać sygnał napięcia. Przygotować wywar z nici zamykającej (100 μM) i dodać do komórek w końcowym stężeniu 1 μM. Delikatnie odpipetować do wymieszania. Czas blokowania może się różnić, ale zalecany czas to 10 minut.
8. W razie potrzeby należy pozyskać filmy poklatkowe lub obrazy punktów końcowych w epifluorescencji zarówno do jakościowego mapowania naprężeń, jak i analizy ilościowej (Rysunek 2J i Rysunek 4).
   nuta: Jeśli pożądany jest pomiar naprężenia w wielu punktach czasowych, zainicjuj kasowanie zapisanych sygnałów naprężenia poprzez dodanie pasma odblokowującego. Aby uniknąć nadmiernego płukania, stosuje się wyższe stężenie końcowe nici odblokowującej przy 2 μM w celu zainicjowania reakcji przemieszczenia nici za pośrednictwem palca z nicią blokującą na 3 minuty, co powoduje usunięcie zapisanych sygnałów (rysunek 2J). Delikatnie spłucz nadmiar oligonukleotydów za pomocą HBSS. Sonda naprężenia spinki DNA do włosów styka się z powierzchnią, a komórki są gotowe do kolejnej rundy magazynowania i mapowania napięcia. Odblokowanie sygnałów napięcia nie jest konieczne, jeśli w badaniu interesujący jest tylko jeden punkt czasowy.

Wyniki

Rysunek 1: Przykłady preparatów oligonukleotydów.(A) chromatogram HPLC oczyszczania nici ligandowej Cy3B; B) widma MALDI-TOF-MS produktu; (C) Tabela obliczonej masy i stwierdzonych pików m/z materiału wyjściowego i znakowanego oligonukleotydu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 3-hydroksypikolinowy (3-HPA)	Sigma	Numer katalogowy: 56197	Matryca Maldi-TOF-MS
mPEG-SC	Biochempeg powiedział:	MF001023-2 tys.	Przygotowanie powierzchni
(3-aminopropylo)trietoksysilan	Acros powiedział:	AC430941000	Przygotowanie powierzchni
10x Bufor do lizy czerwonych krwinek	Legenda biologiczna	Numer katalogowy: 00-4333-57	bufor
Nanocząstki złota 8,8 nm, kwas garbnikowy	Nanokompozyt	Indywidualne zamówienie	Przygotowanie powierzchni
Atto647N Ester NHS	Sigma	18373-1MG-F	Fluorofor, preparat oligonukleotydowy
Komora celowa Attofluor, do mikroskopii	Thermo Fisher Naukowy	Certyfikat A7816	Obrazowania
Strzykawki BD tylko z Luer-Lok	BD nauki biologiczne	309657	Komórek
Biotynylowany anty-mysz CD3e	eBionauka	Numer katalogowy: 13-0031-82	Przeciwciało/ligand
Biotynylowana albumina jaja kurzego pMHC (SIINFEKL)	Główny ośrodek NIH Tetramer na Uniwersytecie Emory	nie	Przeciwciało/ligand
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	735078001	Blokuj interakcje niespecyficzne
Sitka do komórek	Biologix (Biblioteka Biologiczna	15-1100	Komórek
Szkiełko nakrywkowe Mini-Rack, teflon	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał C14784	Przygotowanie powierzchni
Ester Cy3B NHS	GE Opieka zdrowotna	PA63101	Fluorofor, preparat oligonukleotydowy
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco	Corning	21-031-CM	bufor
etanol	Sigma	459836	Przygotowanie powierzchni
Zbilansowane sole Hanka (HBSS)	Sigma	Zobacz materiał H8264	bufor
Nadtlenek wodoru	Sigma	H1009	Przygotowanie powierzchni
LA-PEG-SC	Biochempeg powiedział:	HE039023-3,4 tys.	Przygotowanie powierzchni
Zestaw startowy Midi MACS (LS)	Miltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-301	Komórek
Zestaw do izolacji limfocytów T myszy CD8+	Miltenyi Biotec	130-104-075	Komórek
Urządzenia odśrodkowe Nanosep MF	Laboratorium Palla	ODM02C35	Przygotowanie oligo
Szkiełka nakrywkowe okrągłe szklane nr 2	Firma VWR	Numer telefonu 48382-085	Przygotowanie powierzchni
NTA-SAM	Technologie molekularne Dojindo	N475-10	Przygotowanie powierzchni
Żel P2	Bio-rad	1504118	Przygotowanie oligo
kwas siarkowy	Korporacja EMD Millipore	Zobacz materiał SX1244-6	Przygotowanie powierzchni
Octan sulfo-NHS	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 26777	Przygotowanie powierzchni
sprzęt
Kolumna Agilent AdvanceBio Oligonukleotyd C18, 4,6 x 150 mm, 2,7 μm	Nr kat. 653950-702		Preparat oligonukleotydowy
System oczyszczania wody Barnstead Nanopure	Rybak termiczny		Woda
Cel CFI Apo 100× NA 1.49	Nikon		mikroskopia
Kostka Cy5	Chroma		mikroskopia
Urządzenie sprzężone z ładunkiem zwielokrotnionym elektronami (EMCCD)	Fotometria		mikroskopia
Wysokosprawna chromatografia cieczowa	Agilent 1100		Preparat oligonukleotydowy
Źródło epifluorescencji intensywnego światła	Nikon		mikroskopia
Spektrometr masowy czasu przelotu z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI-TOF-MS)	Voyager STR		Preparat oligonukleotydowy
Spektrofotometr UV-Vis Nanodrop 2000	Rybak termiczny		Preparat oligonukleotydowy
Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ti	Nikon		mikroskopia
Doskonały system ustawiania ostrości firmy Nikon	Nikon		mikroskopia
Oprogramowanie NIS Elements	Nikon		mikroskopia
Czteropasmowy TIRF 405/488/561/647 kostka	Chroma		mikroskopia
Sześcian RICM	Chroma		mikroskopia
Wyrzutnia TIRF o długości fali 488 nm (50 mW), 561 nm (50 mW) i 640 nm	Spójne		mikroskopia
Kostka TRITC	Chroma		mikroskopia
Nazwa Oligo	Modyfikacja 5' / Modyfikacja 3'	Sekwencja (od 5' do 3')	używać
15-merowa nici blokująca aminy	Modyfikacja 5': bez modyfikacji Modyfikacja 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Blokowanie sygnału napięcia w czasie rzeczywistym
Linka blokująca 15mer Atto647N	Modyfikacja 5': Atto647N Modyfikacja 3': /3AmMO/	AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TA	Blokowanie sygnału napięcia w czasie rzeczywistym
15-merowa niefluorescencyjna nić blokująca	Modyfikacja 5': bez modyfikacji Modyfikacja 3': brak modyfikacji	A AAA AAC ATT TAT AC	Blokowanie sygnału napięcia w czasie rzeczywistym do analizy ilościowej
4,7 pN pasmo spinki do włosów	Modyfikacja 5': bez modyfikacji Modyfikacja 3': brak modyfikacji	GTGAAATACCGCACAGATGCGT TTGTATAAATGTTTTTTTCATTTAT ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC Certyfikat CAGC (Międzynarodowa Organizacja T	Sonda spinki do włosów
Nić liganda aminowego	Modyfikacja 5': /5AmMC6/ Modyfikacja 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda spinki do włosów
Splot kotwiący BHQ2	Modyfikacja 5': /5ThiolMC6-D/ Modyfikacja 3': /3BHQ_2/	TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT	Sonda spinki do włosów
Nić ligandowa Cy3B	Modyfikacja 5': Cy3B Modyfikacja 3': /3Bio/	CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTT	Sonda spinki do włosów
Pasmo odblokowujące	Modyfikacja 5': bez modyfikacji Modyfikacja 3': brak modyfikacji	TAG: GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT C	Odblokowanie skumulowanego sygnału naprężenia