Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. A. fumigatus Kultura i warunki
- Przygotować minimalną pożywkę agarową z glukozą zgodnie z opisem.
- Doprowadzić pożywkę do pH 6,5 za pomocą 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut.
- Pozostawić do ostygnięcia do temperatury 65 °C.
- Pracując w sterylnym okapie przepływowym, wlej 30 ml schłodzonego podłoża do kolby T75 i pozwól jej ostygnąć, opierając szyjkę kolby na pipecie o pojemności 25 ml, aby utworzyć nachylenie agaru.
- Na agarze rozprowadzić szczep dsRed Af293-Aspergillus fumigatus i inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C + 5% dwutlenku węgla (CO2). Dwie kolby dadzą około 109 konidiów w 5 ml buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przed biotynylacją.
2. A. fumigatus Etykietowanie i przygotowanie
UWAGA: Podczas wykonywania tego testu po raz pierwszy, przygotuj szczep rodzicielski Af293-A. fumigatus. Pobrać próbki obu szczepów do probówek do mikrowirówek i oznaczyć tylko jeden z każdego szczepu, jak opisano poniżej. Pozwoli to na posiadanie konidiów kontrolnych bez koloru i konidiów z jednym kolorem, zarówno dsRed, jak i Alexa Fluor 633 (AF633), w celu przetestowania konfiguracji i sprzętu.
- Zbierz konidia A. fumigatus, zanurzając kulturę w 30 ml PBS + 0,05% Tween-80. Przefiltruj powstałą zawiesinę przez sitko komórkowe 40 μm do probówki o pojemności 50 ml w celu usunięcia fragmentów strzępek.
- Wirować przy 805 x g przez 10 minut, usunąć supernatant i przemyć raz w 20 ml sterylnego PBS. Basen konidiów z dwóch talerzy tego samego szczepu podczas etapu mycia.
- Po etapie przemywania ponownie zawiesić osad w 5 ml PBS i przenieść 1 ml porcji zawiesiny konidialnej do probówek mikrowirówek. 1 ml zawiesiny każdego szczepu jest zwykle wystarczający do obrazowania żywych komórek. Pozostałe porcje zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Odwirować podwielokrotności zawiesiny konidialnej o sile 9 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad konidialny w 1 ml 0,05 M wodorowęglanu sodu (NaHCO3) o pH 8,3.
- Przygotować 10 mg biotyny/200 μl dimetylosulfotlenku (DMSO), rozpuszczając 25 mg biotyny w 500 μl DMSO. Dodać 10 μl roztworu podstawowego biotyny/DMSO do probówki do mikrowirówki, przykryć folią aluminiową i inkubować przez 2 godziny na bujaku w temperaturze 4 °C.
- Podwielokrotnić pozostałą część roztworu podstawowego biotyny/DMSO i zamrozić w temperaturze -20 °C w celu wykorzystania w kolejnych doświadczeniach.
- Wirować przez 10 minut przy 9 300 x g i ostrożnie usunąć supernatant. Zawiesić osad konidialny w 1 ml 100 mM chlorowodorku tris (hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl) o pH 8,0 przez 1 godzinę w celu dezaktywacji swobodnie unoszącej się biotyny.
- Wirować przez 10 minut przy 9 300 x g i ostrożnie usunąć supernatant. Przemyć osad dwukrotnie 1 ml sterylnego PBS i ponownie zawiesić osad w 1 ml PBS.
- Rozpuścić 1 mg Streptawidyny-AF633 w 0,5 ml PBS, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 2 mg/ml. Dodać 10 μl 2 mg/ml streptawidyny-AF633 na 1 ml zawiesiny konidialnej i inkubować przez 40 minut w temperaturze pokojowej na kołysce pokrytej folią aluminiową. Pozostałą Streptavidin-AF633 można zamrozić w podwielokrotnościach do wykorzystania w kolejnych eksperymentach.
- Wirować przez 10 minut przy 9 300 x g i ostrożnie usunąć sklarowany osad. Zawiesić osad konidialny w 1 ml PBS i policzyć konidia za pomocą hemocytometru w rozcieńczeniu 1:1,000 (1:100, a następnie 1:10). Dostosuj stężenie konidiów do 3,6 x 106/ml z pożywką niezależną od CO2, zawiń w folię i przechowuj w temperaturze 4 °C.
nuta: Konidia są teraz oznaczone jako AF633 i będą określane jako FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia.
- Opcjonalnie: Jeśli wymagana jest stymulacja spuchniętymi konidiami, po policzeniu konidiów (krok 2.9) rozcieńczyć konidia do 7,2 x 106/ml w pożywce na bazie azotu drożdżowego (YNB) i dodać 500 μl zawiesiny konidialnej do 4,5 ml pożywki YNB w autoklawowanej kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 ml. Przykryć i umieścić kolbę w inkubatorze z wytrząsaniem (200 obr./min w temperaturze 37 °C) na 6 godzin.
- Przenieść pożywkę do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 805 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i raz umyć w PBS. Ponownie odwirować i ponownie zawiesić osad w 1 ml niezależnego podłoża CO2, co daje 3,6 x 106 konidiów/ml.
UWAGA: Konidia często zbrylają się po spuchnięciu, co utrudnia dokładne liczenie, zaleca się obliczanie na podstawie zliczonej liczby użytych konidiów spoczynkowych.
3. Izolacja ludzkich neutrofili i monocytów
- Pobrać 20 ml krwi żylnej od zdrowych ochotników do dwóch probówek po 10 ml zawierających kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Dla każdego dawcy z osobna wlać 20 ml krwi do probówki o pojemności 50 ml i rozcieńczyć 15 ml PBS.
- Za pomocą strzykawki i żelaznej igły należy podkryć krew 15 ml roztworu do izolacji limfocytów (gęstość 1,077 g/ml). Umieść igłę na dnie probówki i delikatnie wypchnij roztwór do izolacji limfocytów. Wirować przy 630 x g przez 20 minut bez hamulca i przy niskim przyspieszeniu.
- Przygotować PBS, schłodzony na lodzie.
nuta: Kroki 3.4 i 3.5 muszą być wykonane jednocześnie, aby wytworzyć monocyty (3.4) i neutrofile (3.5).
- Za pomocą pastety zbierz warstwę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Jest to warstwa pośrodku między żółtą surowicą (górna) a przezroczystą warstwą roztworu izolującego limfocyty (dolna) i przeniesiona do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
- Napełnić probówkę PBMC do 50 ml zimnym PBS i odwirować przy 582 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant i przemyć dwukrotnie zimnym PBS i ponownie zawiesić w 1 ml PBS na 20 ml krwi dawcy użytej pierwotnie.
- Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:10 do liczenia, dodając 20 μl zawiesiny komórek do 160 μl PBS i 20 μl błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Przygotuj roztwór buforowy, dodając 26 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FCS) i 2,1 ml 0,5 M EDTA do 500 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS). Odwirować komórki przez 10 minut przy 515 x g i ponownie zawiesić w 40 μl roztworu buforowego na 1 x10 7 komórek.
- Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i dodać 10 μl mikrogranulek CD14 na 1 x10 7 komórek, dobrze wymieszać i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C, upewniając się, że probówki są mieszane co 5 minut.
- Przemyć komórki, dodając 1 ml roztworu buforowego na 1 x 107 komórek i odwirować przy 515 x g przez 10 minut.
- Całkowicie odessać supernatant i ponownie zawiesić do 1 x 108 komórek w 500 μl roztworu buforowego.
- Umieścić 1 kolumnę na próbkę na separatorze magnetycznym zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw przemyć kolumnę raz 500 μl roztworu buforowego.
- Odpipetować 500 μl zawiesiny komórek przez kolumnę, poczekać, aż kolumna wyschnie, a następnie przemyć, powtarzając to trzykrotnie roztworem buforowym.
- Umieść nową probówkę o pojemności 15 ml pod kolumną i zdejmij kolumnę z separatora magnetycznego. Następnie wypłukać komórki z kolumny do probówki z 1 ml roztworu buforowego.
- Dodać 4 ml roztworu buforowego i odwirować przy 515 x g przez 10 min, a następnie ponownie zawiesić w 1 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI).
- Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:10 do liczenia, dodając 20 μl zawiesiny komórek do 160 μl PBS i 20 μl błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- Dostosuj stężenie komórek do 6 x 105/ml za pomocą RPMI i zasiej 200 μl na szklanej naczyniu do obrazowania o średnicy 35 mm. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Następnego dnia, przed obrazowaniem, usuń RPMI i dodaj 200 μl podłoża niezależnego od CO2.
nuta: Te monocyty można również różnicować w różne podzbiory makrofagów przed obrazowaniem. Jeśli jest to technika, którą należy zbadać, doskonałym punktem wyjścia jest niedawny artykuł Ohradanova-Repic i wsp.
- Po zebraniu warstwy PBMC usuń całą surowicę i większość roztworu do izolacji limfocytów, ale uważaj, aby nie usunąć małego białego paska z wierzchu czerwonej osadki, ponieważ będzie ona zawierała większość neutrofili.
- Przygotować 10 razy hipotoniczny bufor do lizy, dodając 83 g chlorku amonu (NH4Cl) i 10 g wodorowęglanu potasu (KHCO3) w 1 l sterylnej wody. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Rozcieńczyć ten bulion 10x sterylną wodą i dodać do probówek. Następnie ostrożnie odwróć 3 razy i inkubuj w lodzie przez 15 minut.
- Wirować przy 394 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w hipotonicznym buforze do lizy na 10 minut w lodzie.
- Odwirować przy 394 x g i przemyć dwukrotnie zimnym PBS. Zawiesić w 1 ml pożywki niezależnej od CO2 na dawcę.
- Wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:10 do liczenia, dodając 20 μl zawiesiny komórek do 160 μl PBS i 20 μl błękitu trypanowego. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
- W przypadku mikroskopii dodać 200 μl tej samej zawiesiny komórek do szklanej naczynia obrazowej o średnicy 35 mm.
UWAGA: Obrazowanie neutrofili lub cytometrię przepływową należy rozpocząć natychmiast ze względu na ich skłonność do apoptozy, jeśli nie są stymulowane. Jeśli nie jest to możliwe, neutrofile należy przechowywać na lodzie i zużyć tak szybko, jak to możliwe (w ciągu tego samego dnia).
4. Mikroskopia wideo na żywo
UWAGA: Wybór mikroskopu będzie zależał od tego, co jest dostępne lokalnie, ale konfiguracja mikroskopu będzie musiała zawierać odwrócony stolik, komorę środowiskową podgrzaną do 37 °C i odpowiednie filtry wzbudzenia/emisji dla dsRed (532/561 nm) i AF633 (633 nm). Konidia FLARE nie działają z laserem 488 nm zamiast lasera 532/561 nm dla dsRed. Wykonując ten eksperyment po raz pierwszy, użyj konidiów kontrolnych bez koloru i jednokolorowych, aby przetestować fluorescencję tła i przebijanie między kanałami dsRed i AF633.
- Włączyć grzałkę mikroskopu przed eksperymentem i odczekać wystarczająco dużo czasu, aby komora kontroli środowiska nagrzała się do 37 °C. Czas potrzebny do ustabilizowania się temperatury w komorze będzie różny w zależności od konfiguracji mikroskopu.
- Włącz mikroskop i komputer, a następnie załaduj oprogramowanie do obrazowania. Zamontuj czaszę obrazowania na stoliku mikroskopu i dostosuj ostrość, aby znaleźć ludzkie neutrofile lub monocyty.
- W przypadku dsRed i AF633 ustaw moc lasera na 10%, a czas ekspozycji na 1 s w ustawieniach akwizycji.
- Usunąć szkiełko do obrazowania i dodać 100 μl zawiesiny konidialnej FLARE 3 x 106/ml do odpowiednich studzienek (całkowita objętość 300 μl/studzienkę). Zapisz czas, w którym konidia FLARE są dodawane do naczynia.
- Przywróć slajd na scenę i dostosuj czułość kamery dla dsRed i AF633, aby wyraźnie zobaczyć konidia, ale nie prześwietlić obrazu. Skonfiguruj listę punktów etapu, jeśli wymagane jest pozyskiwanie wielu punktów.
- Obrazowanie należy rozpocząć po ustawieniu ostrości we wszystkich punktach, zoptymalizowaniu kanałów oraz ustawieniu czasu i czasu trwania cyklu. Czas cyklu i czas trwania obrazowania zależą od pytania eksperymentalnego. Celem jest, aby czas cyklu był jak najkrótszy (≤2 min), przy czym 1 minuta pozwoli na dogłębną analizę dynamiki wychwytu.
