Ocena w czasie rzeczywistym aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych

Streszczenie

Źródło: Brunel, S. F. et al., Na żywo obrazowanie aktywności przeciwgrzybiczej przez ludzkie pierwotne neutrofile i monocyty w odpowiedzi na A. fumigatus.J. Vis. Exp. (2017)

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek do analizy aktywności przeciwgrzybiczej u ludzkich neutrofili przy użyciu fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus. Początkowo w neutrofilach wykrywana jest zarówno czerwona, jak i purpurowa fluorescencja, podczas gdy czerwona fluorescencja zmniejsza się z czasem, co wskazuje na degradację konidiów i potwierdza aktywność przeciwgrzybiczą neutrofili.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. A. fumigatus Kultura i warunki

1. Przygotować minimalną pożywkę agarową z glukozą zgodnie z opisem.
   1. Doprowadzić pożywkę do pH 6,5 za pomocą 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) i sterylizować w autoklawie w temperaturze 120 °C przez 20 minut.
   2. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury 65 °C.
   3. Pracując w sterylnym okapie przepływowym, wlej 30 ml s....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
glicerol	Sigma	Zobacz materiał G6279	http://www.sigmaaldrich.com
Kolba T75	Greiner Bio-One	tel. 658 175	http://www.greinerbioone.com/
Pbs	Gibco (firma Gibco)	20012-019	https://www.thermofisher.com/
Tween-80	Fisher Naukowy	10592955	https://nl.fishersci.com/
Filtr 40 μm	Thermo Fisher Naukowy	22363547	https://www.thermofisher.com/
Probówka Falcon 15 ml	Greiner Bio-One	188 261	http://www.greinerbioone.com/
Probówka Falcon o pojemności 50 ml	Greiner Bio-One	227 261	http://www.greinerbioone.com/
MilliQ	Milipory	QGARD00R1	Podobnie działa woda nanoczysta. http://www.merckmillipore.com/
biotyna	Sondy molekularne	Zobacz materiał B-6352	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D5879	http://www.sigmaaldrich.com
Streptawidyna-AF633	Sondy molekularne	S-21375	AF633 jest jedynym przebadanym do tej pory fluoroforem, który pozostaje widoczny w fagosomach. https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/molecular-probes.html
Probówki z krwią EDTA	Greiner Bio-One	455036	Wszelkie probówki z krwią ze środkiem przeciwzakrzepowym powinny działać. http://www.greinerbioone.com/en/start/
Ficoll-Paque Plus	GE Opieka zdrowotna	17-1440-03	http://www3.gehealthcare.com/
Trypan niebieski	Thermo Fisher Naukowy	SV3008401	https://www.thermofisher.com/
HBSS (Sieć HBSS)	Gibco (firma Gibco)	14170112	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
Mikrokulki CD14	Myltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-050-201	Można również zastosować inne metody izolacji monocytów, preferujemy tę metodę, ponieważ zapewnia ona niezmiennie wysoką czystość monocytów bez pracochłonności. http://www.miltenyibiotec.com/en/
Kolumny MS	Myltenyi Biotec	Numer katalogowy: 130-042-201	Zobacz komentarz do mikrokulek CD14. http://www.miltenyibiotec.com/en/
RPMI + Glutamax	Gibco (firma Gibco)	72400-021	https://www.thermofisher.com/uk/en/home/brands/gibco.html
Medium niezależne od CO2	Thermo Fisher Naukowy	18045054	Konieczne, jeśli podczas obrazowania nie ma wystarczającej wymiany CO2. https://www.thermofisher.com/uk/en/home
μ-slide 8-dołkowe szklane dno	Ibidi	Numer katalogowy: 80827	Jest to miska do obrazowania, której używamy, jednak każda szklana miska do obrazowania o odpowiedniej wielkości powinna działać. http://ibidi.com/
System obrazowania żywych komórek UltraVIEW VoX 3D	Perkin Elmer	L7267000	Zawiera oprogramowanie do pomiaru objętości do akwizycji i analizy. http://www.perkinelmer.com/

powiedział: powiedział: