Wykorzystanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez kulki do badania wyjścia synaptycznego z limfocytów T

Streszczenie

Źródło: Céspedes, P. F., et al. Przygotowanie dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki do badania produkcji cząstek synaps immunologicznych komórek T. J. Vis. Exp. (2022)

Ten film ilustruje rekonstrukcję syntetycznych komórek prezentujących antygen za pomocą dwuwarstw lipidowych wspieranych przez koraliki i ich zastosowanie w ocenie wydajności synaptycznej generowanej przez aktywowane limfocyty T.

Protokół

1. Kalibracje gęstości białek na BSLB (dwuwarstwach lipidowych wspieranych przez koraliki)

1. Przed pobraniem niefunkcjonalizowanych kulek krzemionkowych o średnicy 5,00 ±0,05 μm, należy dobrze wymieszać roztwór podstawowy i ponownie zawiesić wszelkie duże grudki kulek osadzone na dnie kolb.
   UWAGA: Kulki krzemionkowe mają tendencję do szybkiego osadzania się, co może prowadzić do błędów liczenia. Mieszać energicznie, pipetując w górę i w dół połowę maksymalnej objętości mikropipety P1000.
2. Rozcieńczyć 1 μl roztworu kulek w 1 000 μl PBS, policzyć kulki za pomocą komory hemocytometru i obliczyć ich stężenie na ml.
   nuta: Barwienie błękitem trypanowym nie jest potrzebne do wizualizacji kulek krzemionkowych.
3. Obliczyć objętość kulek krzemionki potrzebną do uzyskania 5 ×^{10 5} końcowych BSLB na punkt miareczkowania.
4. Przenieś wymaganą objętość kulek krzemionkowych do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
5. Umyj kulki krzemionkowe trzykrotnie 1 ml sterylnego PBS i odwiruj kulki przez 15 s na mikrowirówce stołowej przy temperaturze RT (przy stałej prędkości obrotowej).
   UWAGA: Podczas wyjmowania roztworu myjącego należy unikać naruszania granulki kulki. Mała kolumna buforowa nie wpłynie na rozprzestrzenianie się liposomów tworzących główną mieszankę liposomów, ponieważ znajdują się one również w PBS.
6. Przygotować trzy objętości głównej mieszanki liposomowej w celu złożenia BSLB na przemytych kulkach krzemionkowych (np. jeśli początkowa całkowita objętość kulek krzemionkowych wynosi 20 μl, należy przygotować co najmniej 60 μl głównej mieszanki liposomowej).
7. Do miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE
   1. Przygotować główne mieszaniny lipidów zawierające 5-krotne rozcieńczenia Biotinyl Cap PE.
      1. Rozcieńczyć 0,4 mM Biotinyl Cap PE mol% w 100% matrycy DOPC.
      2. Zmieszać każdy punkt miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE w stosunku 1:1 (obj. obj.) z roztworem 0,4 mM 25% DGS-NTA(Ni) tak, aby końcowe 12,5% mol% lipidów zawierających Ni było obecne we wszystkich miareczkowaniach.
         nuta: 12,5% mol (vol:vol%) lipidów zawierających Ni reprezentuje mieszany skład lipidowy BSLB, na których białka znakowane His mogą być również testowane w równoległych kalibracjach. Na przykład, ponieważ wszystkie stada liposomów są przygotowywane przy tym samym stężeniu molowym, aby osiągnąć docelową mieszaninę mol% w 200 μl końcowej mieszanki liposomów, wystarczy zmieszać 100 μl 25 mol% DGS-NTA zawierającego Ni ze 100 μl 100% mol% DOPC.
   2. Przenieść 5 × 10⁵ przemytych kulek krzemionki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, tak aby w każdej probówce zebrał się jeden punkt miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE.
   3. Dodać główne mieszanki miareczkowania mol% Biotinyl Cap PE do przemytych kulek krzemionki i delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę całkowitej objętości. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, które w nadmiarze niszczą dwuwarstwę lipidową.
   4. Dodaj argon (lub azot) do probówki zawierającej tworzące się teraz BSLB, aby wyprzeć powietrze i chronić lipidy przed utlenianiem podczas mieszania.
   5. Dodać argon do zapasów lipidów o stężeniu 0,4 mM przed przechowywaniem i manipulować przy użyciu sterylnej techniki.
      nuta: Podłącz małą rurkę do butli z argonem/azotem. Przed dodaniem gazu do rurek należy wyregulować regulator butli gazowej tak, aby ciśnienie nie było wyższe niż 2 psi. Podłącz sterylną końcówkę pipety do rurki wylotowej, aby skierować strumień gazu do wnętrza liposomu na 5 sekund i szybko zamknij pokrywę. W przypadku zapasów lipidów należy uszczelnić wieczko probówki folią parafinową przed przechowywaniem jej w temperaturze 4 °C.
   6. Przenieś BSLB do pionowego miksera laboratoryjnego o zmiennym kącie nachylenia (patrz tabela materiałów) i mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, używając mieszania orbitalnego 10 obr./min.
      nuta: Ten krok zapobiegnie sedymentacji kulek podczas tworzenia podpartej dwuwarstwy lipidowej.
   7. Odwiruj kulki, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie przemyj trzykrotnie 1 ml HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar liposomów.
   8. Zablokuj utworzone BSLB, dodając 1 ml 5% kazeiny lub 5% BSA zawierającego 100 μM NiSO₄ w celu nasycenia miejsc NTA i 200 nM streptawidyny, aby równomiernie pokryć wszystkie miejsca zakotwiczenia biotyny na BSLB. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę całkowitej objętości i inkubować w mieszalniku pionowym nie dłużej niż 20 minut przy temperaturze pokojowej i 10 obr./min.
   9. Odwiruj BSLB, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie umyj trzykrotnie 1 ml buforu HBS/HSA (BSA).
      nuta: Umyte koraliki należy przechowywać pionowo z niewielką objętością bufora do płukania zakrywającego BSLB. Unikaj odwodnienia BSLB, ponieważ powietrze zniszczy dwuwarstwę lipidową.
8. Do miareczkowania białek znakowanych His na 12,5% mol BSLB zawierających DGS-(Ni) NTA
   1. Przygotować trzy objętości głównej mieszaniny liposomów zawierającej końcowe 12,5% molowe DGS-NTA(Ni).
   2. Użyj głównej mieszanki liposomów, aby ponownie zawiesić umyte kulki krzemionki i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół połowę całkowitej objętości. Unikaj tworzenia się pęcherzyków, które w nadmiarze uszkadzają dwuwarstwę lipidową.
   3. Dodaj argon (lub azot) do probówki zawierającej tworzące się teraz BSLB, aby wyprzeć powietrze i chronić lipidy przed utlenianiem podczas mieszania.
   4. Dodaj argon do zapasów lipidów o wielkości 0,4 mM przed przechowywaniem i manipuluj przy użyciu sterylnej techniki.
   5. Przenieś BSLB do mieszalnika pionowego i mieszaj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, używając mieszania orbitalnego z prędkością 10 obr./min.
   6. Odwiruj kulki, wirując przez 15 s w temperaturze pokojowej na miniwirówce stołowej, a następnie przemyj trzykrotnie 1 ml HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar liposomów.
   7. Zablokuj utworzone BSLB, dodając 1 ml 5% kazeiny (lub 5% BSA) zawierającej 100 μM NiSO4 w celu nasycenia miejsc NTA na BSLB. Delikatnie wymieszać i inkubować w mieszalniku pionowym nie dłużej niż 20 minut w temperaturze pokojowej i 10 obr./min.
   8. Przemyć trzy razy za pomocą HBS/HSA (BSA) w celu usunięcia nadmiaru roztworu blokującego.
   9. Na nowej 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U przygotować 2-krotne seryjne rozcieńczenia białek.
      1. Przygotować początkowe stężenie 100 nM dla białka będącego przedmiotem zainteresowania w całkowitej objętości 200 μl buforu HBS/HSA (BSA), rozprowadzić 100 μl tego roztworu w pierwszej kolumnie, a pozostałe 100 μl na wierzchu kolumny #2 zawierającej 100 μl buforu HBS/HSA (BSA).
      2. Kontynuuj, przenosząc kolejno 100 μl z kolumny #2 do kolumny #3 i powtórz w razie potrzeby, aby pokryć wszystkie punkty miareczkowania. Pozostawić ostatnią kolumnę serii bez białka, ponieważ zostanie ona wykorzystana jako ślepa próba odniesienia do oznaczania ilościowego.
   10. Ponownie zawiesić przygotowane BSLB w objętości tak, aby 5 × 10⁵ BSLB znajdowało się w 100 μl buforu HBS/HSA (BSA).
   11. Przenieść 100 μl zawiesiny BSLB do studzienek drugiej 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U, tak aby każda studzienka otrzymała 5 × 10⁵ BSLB.
   12. Odwirować drugą płytkę zawierającą BSLB przez 2 minuty w temperaturze 300 × g i RT i odrzucić supernatant.
   13. Przenieść 100 μl objętości z płytki do miareczkowania białek na płytkę zawierającą osadzone BSLB. Delikatnie wymieszać, unikać nadmiernego wytwarzania pęcherzyków podczas pipetowania i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 1 000 obr./min za pomocą wytrząsarki do płytek. Chronić przed światłem folią aluminiową.
   14. Przemyć płytkę trzykrotnie buforem HBS/HSA (BSA), stosując etapy sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
   15. Jeśli rekombinowane białko użyte w kalibracji jest bezpośrednio sprzężone z fluorochromami i ma znane wartości F/P.
   16. Jeśli rekombinowane białko użyte w kalibracji jest nieznakowane lub sprzężone z fluorochromami lub nie jest dostępny żaden wzorzec kulkowy MESF, należy użyć przeciwciał sprzężonych z Alexa Fluor 488 lub 647 o znanych wartościach F/P do barwienia BSLB pokrytego białkiem.
   17. Barwienie nasyconymi stężeniami przeciwciał kwantyfikacyjnych.
       UWAGA: W zależności od docelowego poziomu ekspresji, wahają się one od 5 do 10 μg/ml.
   18. Bejcować przez 30 minut przy temperaturze obrotowej i 1 000 obr./min za pomocą wytrząsarki płytowej. Chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej.
   19. Przemyć dwukrotnie buforem HBS/HSA (BSA) i raz PBS, stosując etapy sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze RT.
       nuta: Użyj PBS, pH 7,4, aby ponownie zawiesić umyte BSLB przed akwizycją. Nie należy stosować zawierających białko, ponieważ prowadzi to do tworzenia się pęcherzyków podczas automatycznego mieszania próbek z próbnikami o wysokiej przepustowości.
   20. Zdobądź wzorce MESF, upewniając się, że najjaśniejsze piki pozostają w liniowym zakresie detekcji dla detektora kwantyfikacyjnego (kanału), jak pokazano na rysunku 1B (vii).
   21. Próbki należy pobierać ręcznie lub za pomocą HTS. W przypadku korzystania z tego ostatniego należy ponownie zawiesić BSLB w 100 μl PBS i uzyskać 80 μl, stosując natężenie przepływu od 2,5 do 3,0 μl/s, objętość mieszania 100 μl (lub 50% całkowitej objętości, jeśli objętość refuzji jest mniejsza), prędkość mieszania 150 μl/s i pięć mieszanek, aby zapewnić monodyspersję BSLB.
   22. Wyeksportuj pliki FCS.
   23. Skoncentruj się na pojedynczych zdarzeniach w analizach (rysunek 2A), ponieważ dublety lub trojaczki wprowadzą błędy w oznaczeniu. Użyj zagnieżdżonej identyfikacji pojedynczych zdarzeń, jak wskazano w kroku 1.2.3 protokołu.
   24. Zmierz MIF każdej frakcji MESF (1-4) i odejmij MIF od pustych kulek, aby wyodrębnić skorygowane MIF (cMIF).
   25. Wykonaj analizę regresji liniowej, aby wyodrębnić nachylenie (b) MESF w stosunku do cMFI obliczonego dla standardów MESF.
   26. Wyodrębnij MIF z każdego punktu miareczkowania i odejmij MFI z kulek bez białka, aby otrzymać cMIF.
   27. Podzielić cMIF z nachyleniem obliczonym w celu wyodrębnienia MESF związanego z BSLB dla każdego punktu miareczkowania.
   28. Podzielić MESF związany z BSLB przez wartość F/P przeciwciała oznaczającego ilościowo, aby wyekstrahować średnią liczbę cząsteczek związanych na BSLB.
   29. Korzystając ze średnicy BSLB (5,00 ± 0,05 μm), ekstrahować powierzchnię kulki (SA = 4pr2) w celu obliczenia końcowej gęstości białka (mol/μm²) na punkt miareczkowania (stężenie białka).
   30. Wykonaj nową analizę regresji stężenia białka w stosunku do gęstości białka, aby obliczyć nachylenie (b) linii najlepszego dopasowania.
       nuta: Stężenie 12,5 mol% DGS-NTA(Ni) nadaje maksymalną zdolność zakotwiczenia około 10 000 molek./μm2 10 bez indukowania niespecyficznej aktywacji limfocytów T lub wpływu na ruchomość boczną SLB.

2. Przeprowadzanie eksperymentów z transferem synaptycznym między limfocytami T a BSLB

1. Przed uruchomieniem eksperymentu z transferem synaptycznym
   1. Zdobądź niefluorescencyjne BSLB, BSLB z fluorescencyjnymi lipidami, niebarwione komórki (lub kulki kompensacyjne; patrz Tabela materiałów) oraz jednokolorowe komórki barwione (lub koraliki kompensacyjne), aby zidentyfikować oddziaływania widma fluorescencji instrumentu. Skoncentruj się na detektorach o wysokim rozkładzie rozlewania się, aby przeprojektować panel polichromatyczny, zwiększyć czułość i zmniejszyć błąd pomiaru w detektorach krytycznych.
   2. Miareczkowanie przeciwciał detekcji w celu znalezienia optymalnego stężenia, umożliwiającego wykrywanie zdarzeń pozytywnych bez uszczerbku dla wykrywania przeciwciał ujemnych.
      nuta: Powtórz ten krok za każdym razem, gdy nastąpi zmiana partii przeciwciał, ponieważ wartości F/P i jasność różnią się w zależności od partii.
   3. Opcjonalnie: Zoptymalizuj napięcia PMT, pobierając próbkę w różnych zakresach napięcia (tj. spacery napięciowe), aby znaleźć PMT prowadzące do optymalnego sygnału w stosunku do szumu (tj. separacji negatywów i dodatnich przy jednoczesnym zapewnieniu, że sygnał najjaśniejszej populacji pozostaje w zakresie liniowym).
2. Pomiar transferu wyjściowego komórek T do BSLB
   1. Przygotować suplementowany RPMI 1640 (w tym przypadku pożywkę R10) zawierający 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 μM aminokwasów endogennych, 10 mM HEPES, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Użyj pożywki R10 do hodowli i ekspansji limfocytów T.
   2. W dniu 1 wyizoluj limfocyty T z komór krwi obwodowej lub układu leukoredukcji (LRS). Użyj zestawów do izolacji i separacji komórek o immunogęstości (patrz tabela materiałów) do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4 + i CD8 +
   .
   3. Wysiewaj komórki w końcowym stężeniu w zakresie od 1,5 do 2,0 × 10⁶ komórek/ml, używając 6-dołkowych płytek o łącznej zawartości nie większej niż 5 ml na dołek.
   4. Aktywuj limfocyty T za pomocą kulek magnetycznych w stosunku 1:1 do aktywacji ludzkich limfocytów T (anty-CD3 / anty-CD28) (patrz tabela materiałów) i dodaj 100 IU rekombinowanej ludzkiej IL-2 w celu wsparcia proliferacji i przeżycia komórek.
   5. W dniu 3 usuń aktywujące kulki magnetyczne za pomocą kolumn magnetycznych (patrz Tabela Materiałów). Upewnij się, że koraliki magnetyczne pozostają przymocowane do boków rurki przed odzyskaniem komórek w celu wykonania dodatkowych etapów mycia.
   6. Umyj kulki magnetyczne jeszcze raz 5 ml świeżej pożywki R10, dobrze wymieszaj i włóż je z powrotem do magnesu. Odzyskaj tę objętość i wymieszaj ją z komórkami odzyskanymi w kroku 1.2.5.
   7. Ponownie zawiesić komórki na 1,5-2 × 10⁶ komórek/ml w świeżym R10 zawierającym 100 U/ml IL-2. Uzupełnić pożywkę po 48 godzinach, upewniając się, że ostatnie dodanie IL-2 nastąpiło 48 godzin przed dniem eksperymentu (dni od 7 do 14 hodowli).
   8. W dniu eksperymentu z transferem synaptycznym przygotuj pożywkę do testu transferu synaptycznego, uzupełniając pożywkę RPMI 1640 wolną od czerwieni fenolowej 10% FBS, 100 μM aminokwasów endogennych, 2 mM L-glutaminy, 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Nie należy włączać rekombinowanej ludzkiej IL-2.
   9. Policz komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym lub wykluczenia prądu elektrycznego i ponownie je zawiesić do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml w pożywce. Jeśli obserwuje się nadmierną śmierć komórek (>10%), usuń martwe/umierające komórki za pomocą mieszaniny polisacharydu i diatrizoinianu sodu (patrz Tabela materiałów) w następujący sposób:
      1. Warstwę 15 ml hodowli komórkowej nałożyć na 13 ml roztworu ditrizoinianu polisacharydu i sodu.
      2. Wirować do 1 250 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej przy minimalnym przyspieszaniu i zmniejszaniu. Zebrać warstwę komórkową (chmurę) na granicy faz między pożywką a roztworem diatrizoinianu polisacharydu i sodu.
      3. Przemyć komórki co najmniej dwukrotnie podgrzanym roztworem do testów transferu synaptycznego (przygotowanym w kroku 1.2.7).
      4. Policz i ponownie zawieś komórki do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶/ml za pomocą pożywki do testu transferu synaptycznego. Kokultura 100 μl tej zawiesiny komórek z BSLB (patrz krok 1.2.15).
   10. Obliczyć liczbę BSLB potrzebnych do eksperymentu; należy wziąć pod uwagę wszystkie różne główne mieszanki białek i miareczkowanie antygenów, które mają być badane (albo biotynylowane monomery peptydowe HLA/MHC, albo monobiotynylowany anty-CD3ε Fab).
   11. Złóż BSLB, wykonując te same czynności co w sekcji 5 protokołu, ale tym razem połącz wszystkie miareczkowania białek i lipidów wymagane do odtworzenia złożonej błony APC (Figura 3A). Zachowaj te same zależności objętościowo-objętościowe między początkową objętością kulek krzemionki a objętością mieszanki białkowej użytej podczas kalibracji, a także czasy i temperatury używane do ładowania BSLB. Na przykład, jeśli do wstępnej kalibracji użyto 0,5 μl kulek krzemionki / studzienki i 100 μl / studzienki mieszanki białkowej, utrzymuj proporcje 5: 1 000 obj. i obj., aby przygotować BSLB do kohodowli z limfocytami T.
   12. Po załadowaniu BSLB mieszanką białkową, która Cię interesuje, przemyj je dwukrotnie HBS/HSA (BSA), aby usunąć nadmiar niezwiązanych białek. Stosować prędkość sedymentacji 300 × g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej na każdym etapie płukania i odrzucić supernatanty.
   13. Zawiesić 5 × 105 BSLB na studzienkę w 200 μl.
   14. Przenieś 100 μl na studzienkę na nową 96-dołkową płytkę z dnem w kształcie litery U, aby uzyskać duplikat, tak aby ostateczna ilość BSLB na studzienkę wynosiła 2,5 × 10⁵.
   15. Odkręcać BSLB o masie 300 × g przez 2 minuty i RT, a następnie wyrzucić supernatant.
   16. Zawiesić BSLB za pomocą 100 μl zawiesiny limfocytów T; delikatnie wymieszać, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków.
   17. Inkubować kokultury przez 90 minut w temperaturze 37 °C.
       nuta: Alternatywnie, komórki i kulki można ponownie zawiesić w buforze HBS/HSA (BSA) zamiast RPMI wolnego od czerwieni fenolowej dla kokultury. W takim przypadku inkubację należy przeprowadzić w inkubatorze innym niż CO_{2 ,} ponieważ gaz ten szybko zakwasi bufor przy braku wodorowęglanu.
   18. Schłodzić kokultury komórek BSLB-T, najpierw inkubując komórki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut. Chronić je przed światłem.
   19. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy stężeniu 500 × g i temperaturze pokojowej; odrzucić supernatant.
   20. Ponownie zawiesić komórki w RT 2% BSA-PBS (wolne od Ca₂⁺ i Mg₂⁺) w celu zablokowania. Umieść komórki na lodzie na 45 minut. Chronić przed światłem.
   21. Podczas inkubacji komórek przygotuj główną mieszankę przeciwciał, używając lodowatego filtra 0,22 μm 2% BSA w PBS jako buforu barwiącego, który zapewni dodatkowe blokowanie.
       nuta: Niektóre partie przeciwciał sprzężonych z barwnikami Brilliant Violet mają tendencję do niespecyficznego wiązania się z BSLB. Blokowanie za pomocą 5% BSA-PBS pomaga zredukować ten szum. Od teraz upewnij się, że łańcuch chłodniczy nie zostanie przerwany.
   22. Wirować kokultury w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przed wyrzuceniem supernatantów należy na krótko upewnić się, że osad jest obecny, sprawdzając spód płytki 96-dołkowej za pomocą podświetlenia.
   23. Za pomocą pipety wielokanałowej ponownie zawiesić komórki w mieszance wzorcowej barwienia zawierającej zoptymalizowane stężenia przeciwciał.
       nuta: Używaj końcówek do pipet bez filtra, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i błędom w rozkładzie objętości barwienia.
   24. Uwzględnij komórki znakowane izotypem i BSLB, fluorescencyjne i niefluorescencyjne BSLB oraz komórki i BSLB barwione samodzielnie. Przestrzegaj całkowitej liczby zdarzeń na basenik dla wszystkich kontrolnych (tj. tylko BSLB zawierających 5 ×^{10 5} BSLB/basenik i tylko kontrole komórek zawierających 5 × 10⁵ komórek/basenik, aby uniknąć względnego wzrostu przeciwciał na zabarwione zdarzenie).
   25. Delikatnie wymieszać, pipetując w górę i w dół połowę objętości i inkubować przez 30 minut na lodzie. Chronić przed światłem.
   26. Umyć komórki i BSLB dwukrotnie, używając lodowatego 2% BSA-PBS, pH 7,4 i etapów sedymentacji 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić umyte kokultury w 100 μl PBS i natychmiast uzyskać.
   27. Jeśli potrzebne jest utrwalenie, utrwal za pomocą 0,5% w/v PFA w PBS przez 10 minut, umyj raz i trzymaj w PBS do momentu nabycia. Chronić przed światłem.
   28. Przed kompensacją należy uzyskać standardy MESF, zapewniając, że zarówno najciemniejsze, jak i najjaśniejsze populacje mieszczą się w liniowym zakresie pomiaru.
   29. Pobierz próbki kompensacji, oblicz kompensację i zastosuj macierz kompensacji (link) do eksperymentu.
   30. Zdobądź i zapisz co najmniej 2 ×^{10 4} łącznych wzorców MESF dla każdego z kanałów kwantyfikacji.
   31. W przypadku akwizycji za pomocą próbników o wysokiej przepustowości należy ustawić akwizycję przyrządów na standardową, ustawić akwizycję próbki na 80 μl (lub 80% całkowitej objętości), natężenie przepływu próbki między 2,0 a 3,0 μl/s, objętość mieszania próbki 50 μl (lub 50% całkowitej objętości, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków podczas mieszania), mieszanie próbki 150 μl/s, i mieszanie na studzienkę od 3 do 5.
   32. Zdobądź co najmniej 1 × 10⁴ pojedynczych BSLB na próbkę (patrz panele 3B (i)-(vi) dla referencyjnej strategii bramkowania).
   33. Umyj cytometr działający przez 5 minut roztworem czyszczącym, a następnie 5 minut ultraczystej wody przed wyłączeniem instrumentu. Jeśli korzystasz z HTS, postępuj zgodnie z opcjami na karcie HTS i opcji Wyczyść.
   34. Eksport plików FCS.

3. Pomiar transferu synaptycznego cząstek do BSLB

1. Otwórz pliki FCS eksperymentu. Wybierz populację komórek i BSLB na podstawie ich bocznych i przednich obszarów rozpraszania światła (SSC-A kontra FSC-A), jak pokazano na rysunku 3B (i).
2. Wybierz zdarzenia w oknie ciągłego akwizycji (Rysunek 3B (ii)).
3. Skoncentruj się na pojedynczych zdarzeniach obu komórek i BSLB; najpierw zidentyfikuj pojedyncze komórki na podstawie niskiego W w sekwencyjnych bramkach FSC-W/FSC-H (singlets-1, Rysunek 3B panel (iii)) i SSC-W/SSC-H (singlets-2; Rysunek 3B panel (iv)). Zdefiniuj dodatkową bramkę singlets-3, wybierając zdarzenia z proporcjonalnymi FSC-A i FSC-H (Rysunek 3B, panel (v)).
4. Ekstrahować MFI z frakcji MESF w stanie ślepej próby i od 1 do 4 oraz z pojedynczych komórek i MESF dla każdej próbki doświadczalnej.
5. Generowanie skorygowanych wartości MIF (cMFI) dla frakcji MESF od 1 do 4, odejmując MFI populacji ślepych kulek od każdej frakcji.
6. Wygeneruj cMIF dla pojedynczych BSLB i komórek (patrz panel (i)), rys. 3C).
7. Użyj sygnału z BSLB wybarwionego przeciwciałami kontrolnymi izotypu, aby skorygować MFI BSLB wybarwionego przeciwciałami przeciwko odpowiednim markerom limfocytów T. Za pomocą cMFI można obliczyć procent znormalizowanego transferu synaptycznego (NST%) za pomocą równania pokazanego na rysunku 3C panel (ii).
8. Jeśli zamiast tego interesują nas cząstki specyficznie przenoszone w odpowiedzi na wyzwolenie TCR, odejmij sygnał od zerowych BSLB od MFI agonistycznych BSLB. Użyj tego cMFI do obliczenia NST% sterowanego przez TCR, korzystając z równania pokazanego na rysunku 3C panel (ii).
9. Jeśli jesteś zainteresowany określeniem całkowitej liczby cząsteczek przenoszonych jako ładunek cząstek przez granicę faz limfocytów T-BSLB, zdobądź kulki wzorcowe MESF przy użyciu tych samych ustawień przyrządu i sesji akwizycji dla kokultur limfocytów T-BSLB.
10. Przeanalizuj populacje ściegów MESF i wyodrębnij ich cMFI. Oblicz nachylenie linii najlepszego dopasowania dla analizy regresji MESF nad cMFI.
11. Użyj obliczonego nachylenia, aby wyodrębnić liczbę MESF zdeponowanych na BSLB. Użyj cMFI obliczonych przy użyciu kontrolek izotypu lub zerowego BSLB jako ślepych miejsc, aby wyodrębnić liczbę MESF przeniesionych specjalnie do stymulujących BSLB.
12. Obliczyć liczbę cząsteczek markerów przeniesionych do BSLB, dzieląc obliczone (średnie) MESF na BSLB przez wartość F/P przeciwciała do oznaczania ilościowego.

Wyniki

Rysunek 1: Bezwzględna kwantyfikacja białek na powierzchni APC. (A) Przykład ilościowych pomiarów metodą cytometrii przepływowej ICAM-1 na powierzchni komórek B migdałków (Foll. Bc) i limfocyty T pomocnicze (TFH). (i-vii) Strategia bramkowania do analizy pojedynczych CXCR5+ Bc i TFH wyizolowanych z ludzkich migdałków podniebiennych. Pokazano strategię bramkowania se...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
96 Well Cell Cultture Plate U-bottom z pokrywką, poddana działaniu hodowli tkankowej, niepirogenna	Costar®	Numer katalogowy: 3799	Do barwienia FCM i kohodowli BSLB i komórek.
96 Płytka do hodowli komórek dołkowych V-bottom z pokrywką, hodowla tkankowa poddana obróbce, niepirogenna.	Costar®	3894	Do barwienia FCM komórek lub kulek w zawiesinie.
Alexa Fluor 488 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A20000
Alexa Fluor 647 NHS Ester (ester sukcynimidylu)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen™	A37573 oraz A20006
Multiwell 6-dołkowa hodowla tkankowa poddana działaniu próżniowej plazmy gazowej	sokół	353046	Do hodowli i namnażania oczyszczonych limfocytów T CD4+ i CD8+.
Kazeina z mleka krowiego, odpowiednia jako substrat dla kinazy białkowej (po defosforylacji), oczyszczony proszek
Dynabeads Ludzki aktywator T CD3/ CD28	ThermoFisher Scientific, Gibco	Numer katalogowy 11132D
DynaMag-2	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	Numer katalogowy 12321D	Do usuwania Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 w objętościach mniejszych niż 2 ml
DynaMag-15™	ThermoFisher Scientific, Invitrogen™	Numer katalogowy 12301D	Do usuwania Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 w objętościach mniejszych niż 15 ml
Kwalifikowana płodowa surowica bydlęca, jeden Sho	ThermoFisher Scientific, Gibco	A3160801	Wymaga inaktywacji cieplnej przez 30 minut w temperaturze 56 oC
anty-ludzki CD154 (CD40L), klon 24-31	Legenda biologiczna	310815 i 310818	Koniugaty Alexa Fluor 488 i Alexa Fluor 647
Chomik ormiański IgG Alexa Fluor 647 Kontrola izotypu, klon HTK888	Legenda biologiczna	400902	Oznaczone we własnym zakresie za pomocą Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester)
Konfiguracja cytometru BD i kulki śledzące	Becton Dickinson & Company (BD)	641319	Ścieżka wyników instrumentów przed ilościowym FCM