Poniższa metoda jest dostosowana do testowania konkurencyjnych szczepów ze szczepami produkującymi inhibitory.
UWAGA: Ten protokół obejmuje wytwarzanie aerozoli z kulturami bakterii. Można to zrobić tylko w zamkniętej przestrzeni z zastosowaniem lokalnie zatwierdzonych względów bezpieczeństwa. Rozpylanie kultury na płytki agarowe w komorze bezpieczeństwa poziomu 2 zminimalizuje zanieczyszczenie płytek agarowych i otaczającego środowiska. Będzie to również chronić badacza przed wdychaniem aerozoli rozpylonych bakterii, co jest poważnym problemem, jeśli badacz używa organizmów o poziomie hermetyczności 2. Należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. Obszar wokół szalki Petriego najlepiej pokryć jednorazową chusteczką chłonną. Zaleca się odkażanie po rozpyleniu za pomocą światła UV.
1. Przygotowanie płytek agarowych
- Przygotuj agar do infuzji serca (BHI) zgodnie z instrukcjami producenta.
- Autoklawować agar BHI w temperaturze 121 °C, 15 funtów siły na cal kwadratowy (psi) przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu w celu sterylizacji.
- Wlej 15 ml porcji wysterylizowanego agaru BHI do sterylnych szalek Petriego i pozwól mu zastygnąć.
nuta: Upewnij się, że każda płytka agarowa, która ma być użyta w teście, pochodzi z tego samego zapasu agaru i że na każdej płytce znajduje się taka sama ilość agaru. Ogranicza to zmienność dostępnych składników odżywczych i dyfuzję inhibitorów między płytkami, umożliwiając porównywanie.
2. Przygotowanie sterylnego bulionu
- Przygotuj bulion BHI zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dodać 10 ml porcji BHI do 28 ml szklanych butelek uniwersalnych.
- Bulion BHI należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi przez 20 minut lub zgodnie z zaleceniami producenta autoklawu.
nuta: Upewnij się, że cały bulion użyty w teście pochodzi z tej samej partii bulionu autoklawowanego w tym samym czasie, aby ograniczyć zmienność składników odżywczych, która może powodować różnice w wynikach.
3. Przygotowanie sterylnej butelki do waporyzatora
- Zdemontuj butelkę waporyzatora.
- Rozpyl 5% powierzchniowo aktywny środek czyszczący przez waporyzator, aby wyeliminować zanieczyszczenia wewnętrzne, a następnie zanurz butelkę waporyzatora, pokrywkę i waporyzator w 5% powierzchniowo aktywnym środku czyszczącym przez noc.
nuta: Podczas pracy ze środkami czyszczącymi czynnymi powierzchniowo należy używać rękawic i odpowiednich środków ochrony osobistej.
- Wysuszyć waporyzator, pokrywkę i butelki pod sterylnym kapturem z przepływem powietrza.
- Napełnij butelkę 70% etanolem, ponownie podłącz waporyzator i rozpyl trochę etanolu przez waporyzator.
- Załóż pokrywkę na waporyzator i przechowuj w nim etanol do czasu użycia.
- Bezpośrednio przed użyciem należy aseptycznie przepłukać butelkę sterylnym bulionem BHI i spryskać bulion przez parownik.
nuta: Zapobiega to wpływowi etanolu na inokulum dodawane do butelki w sekcji 6.3.
4. Przygotowanie nocnej hodowli bakteryjnej
- Szczepy konkurenta i inhibitora należy umieścić na sterylnej płytce z agarem BHI i inkubować w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych przez około 18 godzin (przez noc).
nuta: Płytka ta wytwarza zapas bakterii, który może być wykorzystany do wielu powtórzeń w ciągu tego samego tygodnia, gdy jest przechowywany w temperaturze 4 °C.
- Zaszczepić 10 ml sterylnego bulionu BHI pojedynczą kolonią wymaganego konkurencyjnego szczepu bakteryjnego w uniwersalnej butelce o pojemności 28 ml.
- Inkubować butelkę uniwersalną w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc, wytrząsając z prędkością 250 obr./min w wytrząsarce orbitalnej.
5. Hodowla punktowa izolatu wytwarzającego inhibitory
- Przygotować kulturę (kultury) na noc zgodnie z opisem w sekcji 4.
- Upewnij się, że płytki agarowe są całkowicie suche, bez kondensacji na pokrywce, przed inokulacją (np. poprzez inkubację płytki przez 60 minut w temperaturze 37 °C); zapobiega to rozprzestrzenianiu się inokulum po płytce z miejsca inokulacji.
- Odpipetować pipetą 25 μl nocnej kultury na środek płytek agarowych. Unikaj całkowitego wciskania tłoka pipety, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, które rozpylają kulturę na agarze .
- Pozostaw kulturę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej, aby ograniczyć rozprzestrzenianie się kultury. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc.
6. Przygotowanie inokulum w sprayu szczepu (szczepów) uczestnika testu
- Przygotować posiew przez noc zgodnie z opisem w punkcie 4. Rozcieńczyć kulturę przez noc 10-krotnie w bulionie BHI, aby uzyskać około 4 x 106 jednostek tworzących kolonie (CFU) ml-1 i zawiesinę OD600 0,3 ±0,05,
nuta: 10-krotne rozcieńczenie nie da 4 x 106 CFU ml-1 dla wszystkich gatunków bakterii, należy obliczyć niezbędny współczynnik rozcieńczenia, rozprowadzając seryjne rozcieńczenia posiewu między 1 x 10-1-1 x 10-6.
- Wlej rozcieńczoną kulturę do sterylnej plastikowej butelki na waporyzator perfum.
nuta: Całkowita objętość musi być większa niż jest to konieczne dla liczby opryskiwanych płytek agarowych. Około 250 μl na płytkę wystarcza na szalkę Petriego o średnicy 9 cm.
7. Test odroczonego hamowania wzrostu
- Rozpyl kulturę przez każdą z butelek parownika, aby upewnić się, że kultura została załadowana do mechanizmu rozpylającego przed rozpyleniem na agar
.
- Z odległości około 15 cm nad agarem rozpylić około 250 μl rozcieńczonej kultury (3 rozpylenia typowego parownika o pojemności 50 ml) na całą powierzchnię agaru. Inkubować płytki agarowe w temperaturze 37 °C w temperaturze tlenowej przez noc. Powtórz dla innych płytek z taką samą liczbą rozpyleń.
8. Interpretacja wyników testu hamowania odroczonego wzrostu
- Zmierz strefę zahamowania wzrostu rozpylonego szczepu konkurencyjnego (Rysunek 1A-C, "X" do "X") w milimetrach, odejmując średnicę centralnego miejsca inhibitora-producenta (Rysunek 1A-C, "Y" do "Y").
UWAGA: Rysunek 1E pokazuje, w jaki sposób można przedstawić te dane
- Zapisać wynik klarowności dla stref inhibicji.
nuta: Wskazuje to na zaobserwowany stopień zahamowania. Przykłady przedstawiono na rysunku 1A-D, szczepy, które można wykorzystać do standaryzacji, sugerowano w sekcji reprezentatywnych wyników. Do oceny klarowności można użyć następującej skali: wynik klarowności równy 0 w celu opisania strefy całkowitego zahamowania wzrostu konkurencyjnego szczepu. Wynik 1 opisuje strefę prawie całkowitego zahamowania wzrostu, w której znajdują się tylko pojedyncze kolonie. Wynik 2 opisuje widoczną strefę zmniejszonego wzrostu, wzrost w tej strefie jest zlewający się lub prawie zlewający, ale ma zmniejszoną gęstość o >50%. Wynik 3 opisuje tylko minimalne ograniczenie wzrostu, wzrost jest zlewany i zmniejszony o mniej niż 50%, a strefa jest nadal widoczna i mierzalna. Wynik 4 opisuje brak widocznego zahamowania wzrostu. Wynik 5 oznacza, że wzrost konkurencyjnego szczepu był zwiększony w pobliżu szczepu wytwarzającego inhibitor testowy. Przykłady przedstawiono na rysunku 1. Wyniki te są subiektywne dla eksperymentatora.
