Test komórkowy do identyfikacji czynników oddziałujących z CXCR4

Streszczenie

Źródło: Claes, S. et al., A Test mobilizacji Ca²⁺ oparty na fluorescencji kinetycznej do identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G.J. Vis. Exp.(2018)

Ten film ilustruje test komórkowy z udziałem komórek glejaka wyrażających receptory chemokiny CXCR4. Test wykorzystuje barwnik wrażliwy na wapń do pomiaru zmian fluorescencji po interakcji z czynnikiem, oferując wgląd w dynamikę sygnalizacji komórkowej.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w sekcjach 1 i 2 są wykonywane w sterylnych warunkach w komorze laminarnej.

1. Konserwacja U87. Komórki CD4.hCXCR4

1. Hodować komórki w kolbach hodowlanych T75 w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w wilgotnym inkubatorze.
   nuta: Linia komórkowa in vitro wykorzystana w tym protokole to linia komórkowa glejaka U87 stabilnie eksprymująca klaster różnicowania 4 (CD4) i ludzki receptor chemokiny CXC 4 (CXCR4) i została wcześniej opisana. Ekspresja CD4 i CXCR4 na powierzchni komórki jest stale monitorowana za pomocą cytometrii przepływowej, a poziomy ekspresji pozostają stałe w czasie (~ 100% komórek CD4 ⁺ i ~ 100% CXCR4 ⁺). Szczegółowy opis wytwarzania wykorzystanej linii komórkowej i procedury cytometrii przepływowej w celu zbadania poziomów ekspresji receptorów nie wchodzi w zakres niniejszego protokołu.
   1. Subkulturuj komórki przy zbiegu 80-85%. Pozwól, aby wszystkie odczynniki osiągnęły temperaturę pokojową (RT) przed hodowlą komórek.
   2. Usunąć kondycjonowaną pożywkę hodowlaną z komórek i przemyć jednokrotnie monowarstwę komórek 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
   3. Dodaj 3 ml 0,25% kwasu trypsyna-etylenodiaminotetraoctowego (trypsyna-EDTA) i rozprowadź równomiernie na monowarstwie komórki. Następnie usunąć nadmiar trypsyny-EDTA i inkubować do 5 minut w temperaturze 37 °C, aż komórki zaczną się odłączać.
   4. Dodać 10 ml świeżej, kompletnej pożywki wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 0,01 M kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) + odpowiednie środki selekcyjne). Ponownie zawiesić komórki, delikatnie pipetując je w górę i w dół. Przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o pojemności 50 ml.
   5. Policz liczbę żywotnych komórek przy użyciu wybranej metody. W przypadku komórek glejaka wielopostaciowego U87 żywotność na ogół osiąga ~ 100%.
      nuta: Numery komórek można określić na kilka sposobów. Rutynowo korzystamy ze zautomatyzowanego systemu analizy komórek opartego na barwieniu błękitem trypanowym (patrz Tabela Materiałów) zgodnie ze standardowymi procedurami obsługi, ale inne sposoby powinny działać równie dobrze.
   6. Dodać 2 x 10⁶ lub 3 x 10⁶ (żywotne) komórki do końcowej objętości 25 ml świeżej pożywki w kolbie hodowlanej T75 i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO₂).
      nuta: Jeśli użyje się komórek 3 x 10⁶, komórki osiągną 80-90% konfluencji po 2 dniach. Jeśli użyjesz komórek 2 x 10⁶, osiągną one tę samą konfluencję po 3 dniach. Szybkość wzrostu komórek należy najpierw określić empirycznie, jeśli używane są inne linie komórkowe.

2. Wysiewanie komórek do testu mobilizacyjnego Ca²⁺

1. W dniu pasażowania komórek (dzień 0) pokryć 96-dołkowe płytki z czarnego polistyrenu o przezroczystym dnie (patrz Tabela materiałów) 0,1% roztworem żelatyny, aby ułatwić przyleganie komórek.
   nuta: Powlekanie płytek 96-dołkowych żelatyną można pominąć, jeżeli stosuje się wstępnie powlekane płytki, które są dostępne w handlu (patrz tabela materiałów). Zaleca się ocenę użycia wstępnie powlekanych płytek zamiast ręcznego powlekania dla każdej badanej linii komórkowej przed kontynuowaniem protokołu.
   1. Przygotować roztwór żelatyny, dodając 1 g żelatyny do 100 ml PBS w celu uzyskania 1% roztworu. Rozcieńczyć 10x PBS przed dalszym użyciem. Aby poprawić rozpuszczalność żelatyny, podgrzać roztwór do 37 °C.
   2. Dodać 100 μl 0,1% roztworu żelatyny do dołka 96-dołkowej płytki za pomocą pipety wielokanałowej. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
2. W międzyczasie przygotuj komórki do wysiewu na powlekanej płytce 96-dołkowej.
   1. Oderwać komórki od kolby hodowlanej, zawiesić je ponownie w świeżej pożywce wzrostowej i policzyć przy użyciu metody barwienia błękitem trypanowym.
   2. Wirować komórki w probówce o pojemności 50 ml przez 5 minut przy 400 x g w temperaturze pokojowej.
   3. Ponownie zawiesić komórki w świeżej pożywce wzrostowej (DMEM + 10% FBS + 1% HEPES, bez antybiotyków), aby uzyskać gęstość komórek 0,1 x 10⁶ (żywotnych) komórek/ml.
3. Usuń roztwór żelatyny z płytek o czarnych ściankach z przezroczystym dnem, odwracając płytkę i susząc ją na chusteczce. Dodać 200 μl/basenik PBS, aby usunąć nadmiar żelatyny i ponownie odwrócić płytkę.
4. Dozować 200 μl zawiesiny komórek (co odpowiada 0,2 x 10⁵ komórek) na studzienkę na 96-dołkową płytkę pokrytą żelatyną (od teraz ta płytka będzie dalej określana jako "płytka pomiarowa").
5. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla (CO₂ ).

3. Ładowanie komórek barwnikiem wrażliwym na fluorescencyjny Ca²⁺

1. W dniu 1 wykonaj rzeczywisty test mobilizacji Ca^{2 +}, zaczynając od obciążenia wysianych komórek fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym Ca^{2 +} fluo-2 acetoksymetyl (fluo-2 AM).
   1. Przygotować bufor testowy, dodając 40 ml HEPES (1 M) do 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS, 10x, bez czerwieni fenolowej, bez wodorowęglanu sodu). Dodać ultraczystą wodę, aby uzyskać końcową objętość 2 l i dodać 4 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Rozpuścić BSA przez mieszanie magnetyczne. Doprowadzić pH do 7,4 (z wodorotlenkiem sodu, NaOH) i przefiltrować roztwór.
      nuta: Podczas wszystkich kolejnych etapów używany jest ten sam bufor, określany jako "bufor testowy".
   2. Przygotować roztwór podstawowy (4 mM w dimetylosulfotlenku (DMSO)) fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na Ca²⁺ fluo-2 AM. Unikaj nadmiernej ekspozycji na światło. Rozpuścić 1 mg fluo-2 AM (masa cząsteczkowa: 1,061 g/mol) w 235,6 μl DMSO.
   3. Przygotuj roztwór roboczy fluo-2 AM. Dla jednej 96-dołkowej płytki testowej wymieszać 12,5 μl roztworu podstawowego fluo-2 AM (4 mM) i 12,5 μl roztworu poliolu niejonowego środka powierzchniowo czynnego (np. pluronu f-127) (20% wagowo-objętościowo w DMSO, patrz Tabela materiałów). Dodać 22 μl tej mieszaniny do 11 ml buforu testowego w probówce o pojemności 15 ml. Końcowe stężenie fluo-2 AM wynosi 4 μM.
      nuta: Niejonowy środek powierzchniowo czynny jest stosowany jako środek dyspersyjny w celu poprawy rozpuszczalności fluo-2 AM w wodzie i w konsekwencji zwiększenia obciążenia komórek. Aby rozpuścić środek powierzchniowo czynny w DMSO, należy podgrzać próbkę w temperaturze 37 °C i regularnie mieszać w celu uzyskania jednorodnego roztworu.
   4. Usuń pożywkę wzrostową z wcześniej zasianych komórek na 96-dołkowej płytce pomiarowej, odwracając płytkę i osuszając ją na ręczniku papierowym.
   5. Dodać 100 μl roztworu barwnika do dołka za pomocą pipety wielokanałowej i inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

4. Przygotowanie 96-dołkowych płytek polipropylenowych zawierających ligand chemokiny CXC chemokine ligand 12 (CXCL12) lub badane związki

1. Zaopatrzyć się w okrągłodenne płytki 96-dołkowe z polipropylenu (PP) (patrz Tabela materiałów).
   1. Pozwolić, aby roztwór podstawowy CXCL12 (1 mg/ml) i roztwór podstawowy badanych związków osiągnęły równowagę w temperaturze RT.
      nuta: Roztwór podstawowy CXCL12 przygotowuje się w ultraczystej wodzie uzupełnionej 0,01% Tween20 i przechowuje w temperaturze -20 °C jako podwielokrotności jednorazowego użytku.
   2. Przygotować 5x stężony roztwór CXCL12 w buforze do oznaczania (250 ng/ml, co odpowiada 31,25 nM) i 5x stężone rozcieńczenie każdego związku (w buforze do testu).
   3. Dozować roztwory podstawowe do odpowiedniej płytki 96-dołkowej zgodnie z predefiniowanym układem płytek. Dozować 75 μl/basenik do płytki zawierającej CXCL12 ("płytka chemokinowa") i dozować 50 μl/basenik do płytki zawierającej związki ("płytka złożona").
      nuta: Zarówno związki, jak i CXCL12 zostaną ostatecznie rozcieńczone 5x po dozowaniu na płytkę pomiarową. Ważne jest również, aby uwzględnić studzienki kontroli ujemnej zawierające tylko bufor do oznaczania zarówno w płytce złożonej, jak i na płytce chemokiny. Należy również uwzględnić studzienki kontroli dodatniej (tj. studzienki z CXCL12 w płytce chemokiny, ale z buforem testowym w odpowiednich studzienkach płytki złożonej).

5. Ustawienia protokołu w czytniku mikropłytek fluorescencyjnych

UWAGA: Czytnik mikropłytek fluorescencyjnych używany w tym protokole jest wymieniony w Tabeli Materiałów.

1. Najpierw włącz chłodnicę czytnika płytek fluorescencyjnych, a następnie włącz sam czytnik fluorescencji. Pozwól na zainicjowanie na kilka minut i otwórz oprogramowanie systemu.
2. Utwórz protokół testu za pomocą menu przeciągnij i upuść, które zawiera następujące kroki:
   1. W polu "Ustawienia" wybierz "Read_Mode" z długością fali wzbudzenia: 470-495 nM; i długością fali emisji: 515-575 nM.
      nuta: Wybrane długości fal są odpowiednie do stosowania z wrażliwym na Ca²⁺ barwnikiem fluo2.
   2. Dołącz pudełko "Wymieszaj z TF" (płyn transferowy) do automatycznego mieszania związków na płytce złożonej, która zostanie umieszczona w 2 pozycjach źródła urządzenia (patrz krok 6.4). Wybrać 15 μl roztworu w każdym dołku, który ma być automatycznie zasysany i trzykrotnie mieszany. Ustaw wysokość końcówek pipet na 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Ustaw prędkość zasysania i dozowania na 50 μl/s.
      nuta: Wysokość końcówek pipet odnosi się do objętości pozostałej pod końcówkami pipet. Na przykład, jeśli studzienki płytki złożonej zawierają 50 μl, wysokość 30 μl odpowiada 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Za pomocą oprogramowania można regulować objętość roztworu złożonego pobranego do wymieszania, prędkość mieszania, położenie końcówek pipet podczas mieszania oraz liczbę cykli mieszania.
   3. W polu "Płyn transferowy" określ, że 20 μl każdego dołka z płytki złożonej zostanie przeniesione na płytkę pomiarową. Umieścić końcówki pipet na głębokości 20 μl poniżej powierzchni cieczy, tj. na wysokości 30 μl podczas zasysania związków i na wysokości 60 μl podczas dozowania na płytce pomiarowej. Ustaw prędkość zasysania na 50 μL/s, a prędkość dozowania na 25 μL/s.
      nuta: Płytka złożona zawiera 50 μl roztworu na studzienkę (patrz krok 4.1.3), a zatem wysokość 30 μl odpowiada umieszczeniu 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Płytka pomiarowa będzie zawierała 80 μl buforu testowego na studzienkę (patrz krok 6.3), a zatem wysokość 60 μl odpowiada podobnemu położeniu końcówek.
   4. Wybierz przycisk "Czytaj za pomocą TF". W pierwszym interwale wybierz 60 odczytów (pomiary fluorescencyjne) z interwałem odczytu wynoszącym 1 s. Zdefiniuj, że 10 odczytów jest rejestrowanych przed dozowaniem związków do płytki pomiarowej, a 50 odczytów później. Zdefiniuj drugi interwał z interwałem odczytu wynoszącym 30 sekund i 18 odczytami.
      nuta: Na tym etapie fluorescencja będzie mierzona kinetycznie (w zdefiniowanych odstępach czasu) łącznie przez ~ 10 minut.
   5. Trzykrotnie umieść przycisk "Wskazówki dotyczące prania" w protokole. Na każdym etapie prania wybierz rodzaj płynu: płyn A (woda ultraczysta) lub płyn B (70% etanolu), liczbę cykli prania (1), prędkość pompy (szybko) i liczbę uderzeń (5) podczas każdego kroku prania.
      nuta: Podczas pierwszego i ostatniego etapu mycia stosuje się płyn A, podczas drugiego etapu prania stosuje się płyn B.
   6. Dołącz funkcję "Pause Pipettor". Ustaw pipetor na pauzę na 300 s.
      nuta: Po uwzględnieniu tego kroku w protokole, głowica pipetora, która jest zintegrowana z czytnikiem płytek fluorescencyjnych, zatrzyma się na 5 minut przed kontynuowaniem protokołu.
   7. Dołącz pudełko "Wymieszaj z TF", aby umożliwić automatyczne mieszanie roztworu CXCL12 w płytce chemokiny, która zostanie umieszczona w pozycji źródła 3 urządzenia (patrz krok 6.4). Wybrać 15 μl roztworu w każdym dołku, który ma być automatycznie zasysany i trzykrotnie mieszany. Podczas zasysania i mieszania należy umieścić końcówki pipet 20 μl poniżej powierzchni cieczy. Prędkość zasysania i dozowania jest ustawiona na 50 μL/s.
      nuta: Podobnie jak w kroku 5.2.2, parametry te można dostosować.
   8. W kolejnym polu "Płyn transferowy" określ, że 25 μl z każdej studzienki płytki chemokinowej zostanie przeniesione na płytkę pomiarową. Umieścić końcówki 20 μl poniżej powierzchni cieczy, tj. na wysokości 55 μl podczas zasysania z płytki chemokiny, która zawiera 75 μl/studzienkę (patrz krok 4.1.3) oraz na wysokości 80 μl podczas dozowania na płytce pomiarowej. Ustaw prędkość zasysania na 50 μL/s, a prędkość dozowania na 25 μL/s.
   9. Dołącz przycisk "Czytaj za pomocą TF". W pierwszym interwale wybierz 145 odczytów z interwałem odczytu wynoszącym 1 s. Zdefiniuj, że 5 odczytów jest rejestrowanych przed dozowaniem CXCL12 do płytki pomiarowej, a 140 odczytów później. Zdefiniuj drugi interwał z czasem interwału odczytu wynoszącym 6 s i wybierz 20 odczytów.
      nuta: Podsumowując, w całym protokole zarejestrowano 243 odczyty (pomiary fluorescencyjne): 78 w kroku 5.2.4 i 165 w kroku 5.2.9.
   10. Podobnie jak w kroku 5.2.5, dołącz trzykrotnie przycisk "Końcówki do prania" w protokole.
       nuta: Uwzględnienie tego kroku na końcu protokołu pozwala na ponowne użycie końcówek do wykonania innego testu bez konieczności wymiany końcówek.
3. Ustaw temperaturę urządzenia na 37 °C, klikając przycisk "Set stage temperature" i wybierając 37 °C.

6. Przeprowadzanie testu fluorescencji

1. Po inkubacji płytki pomiarowej z buforem ładującym przez 45 minut (patrz krok 3.1.5), usunąć bufor, odwracając płytkę i wysuszyć ją na chusteczce.
2. Przemyć wysiane komórki, dodając 150 μl/studzienkę buforu do oznaczania i inkubować przez 2 minuty.
3. Ponownie wyjmij bufor, odwracając płytkę. Dodać 80 μl/basenik buforu do oznaczania za pomocą pipety wielokanałowej.
4. Umieść wszystkie płytki w urządzeniu w odpowiedniej pozycji: płytkę złożoną w pozycji źródła 2, płytkę chemokinową w pozycji źródła 3 i płytkę pomiarową w pozycji odczytu. Umieść pudełko z czarnymi końcówkami w pozycji wskazówek źródła 1. Zamknij drzwi urządzenia i inkubuj przez 5 minut przed kontynuowaniem protokołu.
5. Wybierz przycisk "Test sygnału protokołu", aby określić względne jednostki światła tła (RLU) i wariancję fluorescencji na płycie. Pojawi się nowe okno. Wybierz "Sygnał testowy".
   nuta: Na tym etapie RLU tła są określane przez kamerę ze wzmocnionym ładunkiem sprzężonym z ładunkiem (ICCD), która jest zintegrowana z komorą optyczną czytnika fluorescencji. Te RLU powstają w wyniku wzbudzenia barwnika wrażliwego na Ca²⁺ (fluo-2) przez diody elektroluminescencyjne (LED) (długość fali wyjściowej LED 470-495 nm). Wartości 8 000-10 000 RLU dobrze nadają się do tego zastosowania. W razie potrzeby RLU można dostosować, zmieniając intensywność wzbudzenia (Select Exc. Intensity) lub bramkę kamery (Select Gate Open). Wariancja w stosunku do płytki powinna być idealnie mniejsza niż 7,5%.
6. Wybierz opcję "Aktualizuj", jeśli uzyskane są wartości tła od 8 000 do 10 000 RLU. Zapisz główny protokół, klikając przycisk Zapisz.
   nuta: W ten sposób ustawienia z testu sygnału protokołu zostaną przeniesione do protokołu głównego.
7. Uruchom test, naciskając przycisk "RUN".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Fluo-2 AM	Księga Abcam	ab142775 powiedział	Fluorescencyjny barwnik wrażliwy na Ca2+
Ślusarski F-127	Sigma	Zobacz materiał P2443-250G	Kwas pluronowy
żelatyna	Sigma	Zobacz materiał G9391
AMD3100	Sigma	A5602-5 mg tabletki powlekane	Specyficzny antagonista CXCR4
Marawirok	miły prezent od AnorMed		Lek antyretrowirusowy, antagonista CCR5
Ligand chemokinowy CXCL12	PeproTech	300-28A
Ligand chemokiny CCL5	PeproTech	300-06
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 10270-106
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A1933-25G
Zmodyfikowany Medium Orła Dulbecco (DMEM)	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 41965-039
HBSS (10 x), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 14065-049
HEPESY (1 m)	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 15630-056
Trypsyna-EDTA (0,25 %), czerwień fenolowa	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 25200-056
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)	Gibco (Technologie Życia)	Numer katalogowy: 14190-094
Probówki Falcon, 50 ml	Greiner Bio-One	227 261
Kolba do hodowli tkankowych (T75)	Corning	353024
Talerz, 96-dołkowy, z przezroczystym dnem, z pokrywką	Costar/Fisher Scientific	10530753	Płytka probiercza (96-dołkowa), do wysiewu komórek
Płyty polipropylenowe (PP)	Thermo Scientific (VWR)	tel. 732-2661	Płytki używane do przygotowania płytek złożonych i płytek chemokinowych, okrągłodenne
Wysokoprzepustowy komórkowy system przesiewowy FLIPR Tetra	Urządzenia molekularne		Czytnik płytek fluorescencyjnych ze zintegrowaną głowicą pipetującą i kamerą ICCD
Moduł LED FLIPR Tetra 470 - 495 nm	Urządzenia molekularne	Numer katalogowy: 0200-6128	Diody elektroluminescencyjne do wzbudzenia barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na Ca2+
Filtr emisyjny FLIPR Tetra 515 - 575 nm	Urządzenia molekularne	Numer katalogowy: 0200-6203	Filtr emisyjny kompatybilny z barwnikiem fluorescencyjnym
Głowica FLIPR Tetra 96	Urządzenia molekularne	Numer katalogowy: 0310-4536	96-dołkowa głowica pipetu, zintegrowana z czytnikiem płytek fluorescencyjnych
Prace ekranowe	Urządzenia molekularne		Pakiet oprogramowania służący do analizy i wizualizacji danych na FLIPR Tetra
Vi-CELL (komórka Vi-CELL	Beckman Coulter		Analizator żywotności komórek
Corning CellBIND 96 Płaskie przezroczyste dno Mikropłytki z czarnego polistyrenu, z pokrywką, sterylne	Corning	3340	Wstępnie powlekane 96-dołkowe płytki do oznaczania, które mogą stanowić alternatywę dla ręcznego powlekania płytki do oznaczania.

: ) szt.