1. Pobieranie komórek i pomiar aktywności α-galaktozydazy A lub kwaśnej α-glukozydazy
- Pobieranie komórek
- W dniu zbiorów należy wyjąć komórki z inkubatora i zassać pożywkę. Ostrożnie umyj komórki 2 razy PBS z Ca2+ i Mg2+,
UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ DGJ i DNJ są silnymi inhibitorami odpowiednio α-galaktozydazy i α-glukozydazy, a wszelkie pozostałości unieważniłyby test.
- Dodaj 200 μl wody dejonizowanej bezpośrednio na komórki. Wypłukać komórki z płytki i przenieść je do probówki reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
2. Homogenizacja przez zamrażanie i rozmrażanie
- Umieść próbki w odpowiednim stojaku piankowym i wiruj przez 5 sekund, aby liza była bardziej wydajna. Próbki umieszczać na przemian w ciekłym azocie przez 10 s i w łaźni wodnej o temperaturze pokojowej aż do zakończenia rozmrażania (5 min).
- Powtórzyć tę procedurę 5 razy, a następnie wirować próbki przez 5 minut w temperaturze 10 000 x g. Zachować supernatant i pipetę w nowej probówce reakcyjnej.
3. Oznaczanie stężenia białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA)
- Przygotować świeżą probówkę dla każdej próbki zawierającej 40 μl dejonizowanegoH2Oi dodać 10 μl próbki. Wymieszać roztwór, krótko wirując, i przenieść 10 μl do wnęki na płytce 96-dołkowej (każda próbka w trzech powtórzeniach). Rozcieńczyć roztwór podstawowy albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml w dejonizowanymH2Ow następujący sposób, aby otrzymać krzywą wzorcową: 50 μlH2O/50 μL BSA; 60 μL H2O/40 μL BSA; 70 μL H2O/30 μL BSA; 80 μL H2O/20 μL BSA; 90 μL H2O/10 μL BSA; 100 μL H2O.
- Rozpocząć reakcję od dodania 200 μl odczynnika BCA (odczynnik A i odczynnik B zmieszane w stosunku 50:1) i inkubować przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 37 °C przy lekkim mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). Zmierzyć absorbancję przy 560 nm w czytniku płytek.
nuta: Próbki zazwyczaj zawierają od 1 do 1,5 μg białka na μl.
4. Pomiar aktywności enzymatycznej za pomocą sztucznych substratów 4-metylolumbelliferylu (4-MUG)
- Rozcieńczyć obliczoną ilość każdej próbki i pipetować do świeżych probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml w celu uzyskania 0,05 (dla α-galaktozydazy A) lub 0,5 (dla kwaśnej α-glukozydazy) μg roztworów białka/μl. Ponownie wirować próbki przez 5 s i odpipetować 10 μl tego rozcieńczenia do 96-dołkowej płytki (każda próbka w dwóch egzemplarzach).
- Rozpocznij reakcję od dodania 20 μl odpowiedniego roztworu substratu:
Dla α-galaktozydazy A: 2 mM 4-metylombleczryl-α-D-galaktopyranozyd (4-MU-gal) w 0,06 M buforze cytrynianu fosforanu, pH 4,7,
Dla kwaśnej α-glukozydazy: 2 mM 4-metylolumbelliferylu α-D-glukopiranozydu (4-MU-glu) w 0,025 M octanie sodu, pH 4,0.
- Inkubować reakcje enzymatyczne przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze 37 °C przy lekkim mieszaniu na wytrząsarce orbitalnej (300 obr./min). Zakończyć reakcję przez dodanie 200 μl 1,0 M buforu glicynowo-NaOH o pH 10,5
.
- Przygotować krzywą wzorcową 4-metylolumbelliferonu (4-mu) z zapasu 0,01 mg/ml w następujący sposób:
100 μL H2O / nie 4-MU; 80 μL H2O/ 20 μL 4-MU; 60 μL H2O/ 40 μL 4-MU; 40 μL H2O / 60 μL 4 MU; 20 μL H2O / 80 μL 4 mln μ; bez H2O/ 100 μL 4-MU, odmierzyć pipetą 10 μl każdego rozcieńczenia do płytki 96-dołkowej (w dwóch częściach) i dodać 200 μl 1,0 M buforu glicyny-NaOH do każdej studzienki w celu dostosowania objętości i pH.
- Zmierz aktywność enzymu w czytniku fluorescencji wyposażonym w odpowiedni zestaw filtrów i przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania dla czytnika fluorescencji.
nuta: Oba substraty 4-MUG są redukowane do 4-MU podczas ekspozycji na α-galaktozydazę A lub kwaśną α-glukozydazę. Uwolniony 4-MU jest fluorochromem, który można zmierzyć przy 360 i 465 nm jako długości fal wzbudzenia i emisji, odpowiednio, za pomocą czytnika fluorescencji mikropłytki.
