Ocena skuteczności przeciwwirusowego związku testowego za pomocą testu inaktywacji wirusa

Streszczenie

Źródło: Tai, C. et al., Wczesne testy wprowadzania wirusa w celu identyfikacji i oceny związków przeciwwirusowych. J. Vis. Exp. (2015)

Ten film demonstruje test inaktywacji wirusa, prezentując ocenę wpływu środków przeciwwirusowych na cząsteczki wirusa.

Protokół

1. Test inaktywacji wirusów

Uwaga: Przykłady okresu inkubacji i dawki wirusa dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 1A. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.

1. Wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×^{10 4} komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ O/N w celu uzyskania monowarstwy.
2. Inkubować badane związki lub próby kontrolne (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) z cząstkami HCV w temperaturze 37 °C (rysunek 1A, "Długoterminowe") w stosunku 1:1. Na przykład do 100 μl inokulum wirusa zawierającego 1 x 104 FFU, dodać 100 μl 100 μM roboczego rozcieńczenia; w ten sposób uzyskuje się obróbkę w końcowym stężeniu 50 μM.
3. Rozcieńczyć mieszaninę wirus-lek do "subterapeutycznego" (nieskutecznego) stężenia badanych związków. Na przykład nieskuteczne stężenie i PUG przeciwko HCV wynosi 1 μM31; w związku z tym wymaga to 50-krotnego rozcieńczenia mieszaniny wirusa i leku, co można osiągnąć za pomocą 9,8 ml pożywki podstawowej (pożywka do hodowli komórkowych z 2% FBS).
   Uwaga: Rozcieńczenie do stężenia subterapeutycznego zapobiega znaczącej interakcji między badanymi związkami a powierzchnią komórki gospodarza i umożliwia zbadanie wpływu leczenia na wiriony bezkomórkowe. Należy zauważyć, że rozcieńczenie to zależy od odpowiedzi na dawkę przeciwwirusową badanych związków przeciwko danej infekcji wirusowej i jest określane przed wykonaniem tego konkretnego testu.
4. Dla porównania, wirusa należy zmieszać z badanymi związkami i natychmiast rozcieńczyć (bez okresu inkubacji) do stężenia subterapeutycznego przed zakażeniem (ryc. 1A, "Krótkoterminowe").
5. Dodać 100 μl rozcieńczonej mieszaniny HCV z lekiem na monowarstwę komórek Huh-7,5 (ilość wirusa wynosi teraz 1 x 10² FFU; końcowy MOI = 0,01) i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, aby umożliwić adsorpcję wirusa.
6. Po zakażeniu należy usunąć rozcieńczoną inokulankę i delikatnie umyć studzienki dwukrotnie 200 μl PBS.
   nuta: Wykonuj pranie delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.
7. Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
8. Przeanalizuj powstałą infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy.

Wyniki

Rysunek 1. Inaktywacja zakażeń wirusowych przez badane związki i PUG. Różne wirusy poddawano działaniu badanych związków przez długi okres (inkubacja przez 1,5 – 3 godziny przed miareczkowaniem; jasnoszare paski) lub krótki okres (natychmiastowe rozcieńczenie; ciemnoszare paski) w temperaturze 37 °C przed rozcieńczeniem do stężenia subterapeutycznego i późniejszą analizą infekcji na odpowiednich kom...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (DMEM)	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Numer katalogowy 11995-040
FBS (Sieć Usługowa	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Numer katalogowy 26140-079
Penicylina-Streptomycyna	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Numer katalogowy: 15070-063
Amfoterycyna B	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	Numer katalogowy: 15290-018
Dmso	Sigma	Zobacz materiał D5879
Zestaw do testów toksykologicznych in vitro, oparty na XTT	Sigma	TOX2
PBS pH 7,4	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	10010023
Czytnik mikropłytek	Thermo Scientific	Numer katalogowy: 89087-320
Mikrowirówka	Thermo Scientific	75002420
Zestaw do oznaczania lucyferazy Gaussia firmy BioLux	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	E3300L
Luminometr	Preparat Promega	GloMax-20/20
Cytrynian sodu, dwuwodny	Sigma	Numer telefonu 71402
Chlorek potasu	Sigma	Zobacz materiał P5405