Uwaga: Upewnij się, że wszystkie procedury związane z hodowlą komórkową i infekcją wirusową są przeprowadzane w certyfikowanych kapturach bezpieczeństwa biologicznego, które są odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego przetwarzanych próbek. Do celów opisu protokołów, jako wirus modelowy stosuje się HCV znakowany reporterowo lucyferazy Gaussa. W kontekście reprezentatywnych wyników, związki kwasu chebulagowego () i punikalagininy (PUG) są stosowane jako potencjalne leki przeciwwirusowe, które są ukierunkowane na interakcje glikoprotein wirusowych z glikozaminoglikanami na powierzchni komórki we wczesnych etapach wnikania wirusa. Heparyna, o której wiadomo, że przeszkadza w wnikaniu wielu wirusów, jest stosowana w takim kontekście jako leczenie kontroli pozytywnej.
1. Hodowla komórkowa, preparat złożony i cytotoksyczność związków
- Wyhoduj odpowiednią linię komórkową dla systemu infekcji wirusem, który ma być analizowany (Tabela 1). W przypadku HCV hoduj komórki Huh-7,5 w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 200 U/ml penicyliny G, 200 μg/ml streptomycyny i 0,5 μg/ml amfoterycyny B.
- Przygotować badane związki i kontrole, używając ich odpowiednich rozpuszczalników: na przykład rozpuścić i PUG w dimetylosulfotlenku (DMSO); przygotować heparynę w sterylnej, podwójnie destylowanej wodzie. Do wszystkich kolejnych rozcieńczeń należy użyć pożywek hodowlanych.
Uwaga: Końcowe stężenie DMSO w działaniu badanego związku jest mniejsze niż 1% w doświadczeniach; 1% DMSO jest uwzględniony jako leczenie kontrolą ujemną w testach dla porównania.
- Oznaczyć cytotoksyczność badanych związków (np. i PUG) na komórkach pod kątem zakażenia wirusowego, stosując odczynnik określający żywotność komórek, taki jak XTT (2,3-bis[2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenylo]-5-fenylo)-karbonylo]-2H-wodorotlenek tetrazolu):
- W przypadku HCV wysiewać komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze O/N o stężeniu 5% CO2 w celu uzyskania monowarstwy.
- Zastosować kontrolę DMSO (1%) lub zwiększające stężenia badanych związków i PUG (np. 0, 10, 50, 100 i 500 μM) do dołków hodowlanych w trzech egzemplarzach.
- Inkubować w temperaturze 37 °C przez 72 godziny, następnie wyrzucić pożywkę do płytki i dwukrotnie przemyć komórki 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
- Dodać 100 μl roztworu do oznaczania z zestawu do testów toksykologicznych in vitro na bazie XTT do każdego dołka i inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny, aby umożliwić produkcję formazanu XTT.
- Oznaczyć absorbancję za pomocą czytnika mikropłytek przy badanej długości fali 492 nm i referencyjnej długości fali 690 nm.
- Obliczyć odsetek komórek, które przeżyły, stosując następujący wzór: żywotność komórek (%) = At / As × 100%, gdzie "At" i "As" odnoszą się odpowiednio do absorbancji badanych związków i kontroli rozpuszczalnika (np. 1% DMSO). Określić stężenie 50% cytotoksyczności komórkowej (CC50) badanych związków za pomocą oprogramowania analitycznego, takiego jak GraphPad Prism, zgodnie z protokołem producenta.
2. Odczyt infekcji wirusowej
Uwaga: Odczyt infekcji wirusowej zależy od używanego systemu wirusowego i może obejmować takie metody jak testy płytki nazębnej lub pomiar sygnałów reporterowych od wirusów oznaczonych jako reporter. Metoda wykrywania zakażenia reporter-HCV na podstawie aktywności reporterowej lucyferazy została opisana poniżej.
- Zebrać supernatanty z zainfekowanych studzienek i sklarować w temperaturze 17 000 x g w mikrowirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Zmieszać 20 μl testowego supernatantu z 50 μl substratu lucyferazy z zestawu do oznaczania lucyferazy Gaussia i bezpośrednio zmierzyć za pomocą luminometru zgodnie z instrukcjami producenta.
- Wyraź zakaźność HCV jako log10 względnych jednostek światła (RLU) w celu określenia zahamowania wirusa (%) i oblicz 50% skuteczne stężenie (EC50) badanych związków przeciwko zakażeniu HCV za pomocą algorytmów z oprogramowania GraphPad Prism zgodnie z protokołem producenta.
3. Test wnikania wirusa/fuzji
Uwaga: Przykłady okresów inkubacji i dawek wirusów dla różnych wirusów są wymienione na rysunku 1A 'Entry/Fusion'. Wyższe stężenia wirusa można również badać poprzez zwiększenie MOI/PFU.
- Wysiewaj komórki Huh-7,5 na 96-dołkowej płytce (1 ×10 4 komórki na studzienkę) i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 O/N w celu uzyskania monowarstwy.
- Wstępnie schłodzić monowarstwy komórek w płytkach w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę.
- Zakażenie komórek HCV (mnogość infekcji, MOI = 0,01) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny. Na przykład użyj 100 μl inokulum wirusa zawierającego 1 x 102 jednostki formujące ognisko (FFU).
nuta: Przeprowadzić dodawanie inokulum wirusa na lodzie i następującą po tym inkubację w lodówce o temperaturze 4 °C w celu utrzymania temperatury na poziomie 4 °C, co pozwala na wiązanie wirusa, ale nie na wnikanie.
- Usunąć supernatant i delikatnie przemyć monowarstwy komórek dwukrotnie 200 μl lodowatego PBS.
nuta: Wykonuj pranie delikatnie, aby uniknąć podnoszenia komórek.
- Poddać studzienki działaniu badanych związków lub próbek kontrolnych (końcowe stężenia to: = 50 μM; PUG = 50 μM; heparyna = 1 000 μg/ml; DMSO = 1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny. Na przykład dodać 10 μl roboczego rozcieńczenia 500 μM do 90 μl pożywki, wymieszać i poddać metamorfozę dodzieniom; pozwala to na obróbkę w końcowym stężeniu 50 μM.
nuta: Przesunięcie temperatury z 4 °C do 37 °C ułatwia obecnie wnikanie wirusa/fuzję, a tym samym umożliwia ocenę wpływu badanych związków na ten konkretny etap.
- Odessać supernatant zawierający lek i usunąć niezinternalizowane wirusy zewnątrzkomórkowe przez przemycie 200 μl buforu cytrynianowego (50 mM cytrynian sodu, 4 mM chlorek potasu, pH 3,0) lub PBS. Nałożyć 100 μl podłoża podstawowego przed inkubacją w temperaturze 37 °C przez 72 godziny.
- Przeanalizuj wynikową infekcję, oznaczając supernatant pod kątem aktywności lucyferazy, jak opisano w "2. Odczyt infekcji wirusowej".
