Kolorymetryczne wykrywanie biomarkera bakteryjnego za pomocą zmodyfikowanego papierka lakmusowego

Streszczenie

Źródło: Tram, K., et al. Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą testu lakmusowego. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje kolorymetryczną metodę wykrywania E. coli, polegającą na tym, że biomarker E. coli aktywuje DNAzyme, prowadząc do rozszczepienia wiązania RNA i odłączenia koniugatu DNAzyme-ureaza. Kolejny test kolorymetryczny wykrywa biomarker E. coli poprzez zmiany pH wywołane amoniakiem.

Protokół

1. Przygotowanie komórek E. coli do badania

1. Aby uzyskać pożądaną zawiesinę komórek, przenieś 1 ml bulionu hodowlanego do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
2. Odwirować komórki przy 6 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu komórkowego.
3. Dodać 10 μl buforu reakcyjnego do osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki. Sonikować zawiesinę komórek przez 5 minut. Przenieść zawiesinę komórek do pojemnika na lód na 5 minut.
4. Sonikować zawiesinę komórek przez kolejne 5 minut.
5. Odwirować zawiesinę komórek o sile 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Do badania użyć supernatantu (10 μl).

2. Test lakmusowy

1. W probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml umyj wstępnie probówkę, dodając i wirując 100 μl buforu reakcyjnego (RB) w probówce do mikrofugi i wyrzucając bufor.
2. Przenieść 15 μl zmontowanego EC1 do umytej probówki do mikrofuge.
3. Umyj kulki magnetyczne, umieszczając rurkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym. Usunąć szwadron przez pipetowanie. Wyjmij probówkę do mikrofuge ze stojaka, dodaj 100 μl RB i ostrożnie ponownie zawieś kulki magnetyczne.
4. Umyj płytę główną jeszcze dwa razy, powtarzając krok 2.3.
5. Umieść probówkę do mikrofuge z powrotem na stojaku magnetycznym, usuń supernatant i dodaj 10 μl próbki E. coli przygotowanej z kroku 1.3.
6. Ostrożnie wymieszaj próbkę i kulki magnetyczne, delikatnie stukając w probówkę do mikrofuge.
7. Inkubować reakcję w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
8. Do reakcji dodać 90 μl ddH₂O i umieścić probówkę do mikrofuge na stojaku magnetycznym.
9. Po około 3 minutach separacji magnetycznej ostrożnie przenieść 85 μl supernatantu do probówki o pojemności 0,5 ml. Nadmiar należy powoli odciągać, aby uniknąć gromadzenia się kulek magnetycznych.
10. Do powyższej probówki do mikrofuge dodaj 15 μl 0,04% czerwieni fenolowej i 100 μl roztworu substratu.
11. Rób zdjęcie w określonych odstępach czasu, aby zarejestrować zmianę kolorów.
    nuta: Zmianę pH można również monitorować za pomocą pH-metru z mikroelektrodą. Początkowe pH powinno wynosić około 5,2-5,5 (roztwór jest żółty). Jeśli nie, roztwór można dostosować, dodając 1 mM bufor octanowy pH 5,0).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	VWR AMRESCO	105
Granulki wodorotlenku sodu (NaOH)	BIO BASIC KANADA INC	Zobacz materiał SB6789
Podstawa Tris	VWR AMRESCO	Z numerem 497
mocznik	VWR AMRESCO	Zobacz materiał M123
Ksylenecjanol FF	SIGMA-ALDRICH	Zobacz materiał X-4126
0,04% Czerwień fenolowa	SIGMA-ALDRICH	Zobacz materiał P3532
10x bufor reakcyjny kinazy polinukleotydowej T4	Lucygen	30061-1
E. coli K12 (MG1655)	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC700926
Koralik magnetyczny (BioMag)	Bangs Laboratories Inc
Magnetyczny stojak separacyjny	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	S1506S
Rurki do mikrofuge	Sarstedt	Nr 72,69
Inkubator do hodowli komórkowych	Eppendorf Scientific	M13520000
Myjka ultradźwiękowa Branson	Branson	N/a