Test reporterowy lucyferazy do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych ospą

Streszczenie

Źródło: Dhungel, P., et al. In Vitro transkrybowany test reporterowy lucyferazy oparty na RNA w celu zbadania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem Poxvirus. J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje test do badania regulacji translacji w komórkach zakażonych wirusem poxvirus. Niezakażone i zakażone wirusem komórki były współtransfekowane mRNA kodującymi lucyferazy świetlika (Fluc) i lucyferazy Renilla (Rluc), przy czym mRNA Fluc zawierało sekwencję liderową 5' poli(A). Po dodaniu substratów bioluminescencyjnych na lizowanych komórkach, zmierz sygnał z obu lucyferazy, aby zidentyfikować przewagę translacyjną mRNA Fluc w komórkach zakażonych wirusem, przyznaną przez sekwencję lidera.

Protokół

1. Transfekcja mRNA do komórek

1. Wysiewać komórki HeLa na 24-dołkowej płytce (aby następnego dnia były ok. ~80-90% zlewające się) i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Infekuj komórki HeLa wirusem krowianki (VACV) przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 5 lub zachowaj niezainfekowane komórki HeLa dla porównania.
   nuta: MOI to liczba zakaźnych cząstek wirusa na komórkę.
3. MOI x = {[(liczba komórek * X) / miano wirusa] * 1000} μl wirusa na 1 ml pożywki.
4. Po pożądanym h po infekcji (hpi) (w tym eksperymencie przy 10-12 hpi), transfekuj mRNA (500 ng całkowitego mRNA na dołek 24-dołkowych płytek) za pomocą kationowego odczynnika do transfekcji lipidów, jak pokazano na rysunku 1C.
   1. W przypadku jednej studzienki na 24-dołkowej płytce wymieszaj 480 ng sekwencji 12A zawierającej mRNA lucyferazy świetlika (12A-Fluc) i 20 ng sekwencji Kozaka zawierającej mRNA lucyferazy Renilla (Kozak-Rluc) w jednej probówce do mikrowirówki. Do innej probówki do mikrowirówki dodać 1,1 μl odczynnika do transfekcji kationów lipidowych.
   2. Dodać 55 μl zredukowanej pożywki surowicy do obu probówek. Wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   3. Po 5 minutach inkubacji dodać 55 μl kationowego odczynnika do transfekcji lipidów zawierających zredukowaną pożywkę surowicy do probówki zawierającej mRNA mRNA.
   4. Wymieszaj delikatnie, ale dokładnie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
   5. Podczas inkubacji należy usunąć pożywkę do hodowli komórkowych i dodać 400 μl zredukowanej pożywki surowicy na dołek z 24-dołkowych płytek.
   6. Po inkubacji dodać 100 μl mieszaniny kroplami i równomiernie do jednego dołka z 24-dołkowymi płytkami.

2. Pomiar aktywności lucyferazy

1. Pięć godzin po kotransfekcji 12A-Fluc i mRNA Kozak-Rluc zmierz aktywność lucyferazy za pomocą systemu testowego lucyferazy zdolnego do wykonania dwóch testów reporterowych (np. Zestaw do testów reporterowych z podwójnym lucyferazy).
2. Usuń zredukowaną pożywkę surowicy i poddaj komórki lizie, dodając 150 μl 1x bufor do lizy, składnik zestawu do oznaczania lucyferazy.
3. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej zebrać lizat, złomując komórki i przenieść je do probówki mikrowirówkowej.
4. Odwirować lizat o stężeniu 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia resztek komórek.
5. Dodać 30 μl supernatantu do nieprzezroczystej 96-dołkowej białej płytki testowej z twardym dnem.
6. Zmierz podwójną luminescencję za pomocą zestawu do oznaczania lucyferazy i luminometru z wielomodowym czytnikiem płytek.
7. Wykonać pomiar przy użyciu funkcji kinetyki (w odniesieniu do każdego dołka) przy użyciu ustawień opisanych w tabeli 1.
   nuta: Odczyt można również wykonać za pomocą ręcznego luminometru. Dodaj równą objętość lizatu i substratu dla Fluc do kuwety. Odczekaj 2 s i mierz przez 10 s za pomocą luminometru. Po pomiarze Fluc szybko wyjmij kuwetę z luminometru i ręcznie dodaj równą objętość podłoża dla Rluc. Ponownie odczekaj 2 s i mierz przez 10 sekund za pomocą luminometru.
8. Eksportuj dane odczytu luminescencji do żądanego formatu pliku.
9. Określ względną szybkość translacji z mRNA 12A-Fluc w niezakażonych i zakażonych VACV komórkach HeLa, dzieląc wartość Fluc przez wartość Rluc kontroli wewnętrznej.
   UWAGA: Rysunek 2 przedstawia krok po kroku analizę surowych danych w celu uzyskania względnej aktywności fluc.

Tabela 1: Ustawienia pomiaru lucyferazy - kroki do pomiaru lucyferazy z zalecaną objętością lub czasem.

Kroki	Głośność/czas
Wstrzyknąć substrat do oznaczania lucyferazy (Fluc):	30 μL
Czas oczekiwania / inkubacji:	2 sekundy
Pomiar luminescencji (Fluc):	10 sekund
Podłoże Stop & Glo (Rluc):	30 μL
Czas oczekiwania / inkubacji:	2 sekundy
Pomiar luminescencji (Rluc):	10 sekund

Wyniki

Rysunek 1: synteza i transfekcja mRNA. (A) Schemat transkrypcji in vitro. Jako matrycę stosuje się DNA amplifikowane metodą PCR zawierające gen lucyferazy poniżej 5'-UTR będącego przedmiotem zainteresowania i promotora T7. Polimeraza RNA T7 jest rekrutowana do promotora i dodaje rybonukleotydy, pokazane na biało, w kierunku od 5' do 3'. Gdy mRNA osiągnie długość 25-30 nt, k...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Corning 96 Well Half-Area biała płytka polistyrenowa z płaskim dnem	Corning	3693	Nieprzezroczysta, 96-dołkowa biała płyta z solidnym dnem
System testów reporterowych z podwójnym lucyferazy	Preparat Promega	E1960	Zestaw do oznaczania podwójnej lucyferazy (DLAK)
Luminometr mikropłytkowy GloMax Navigator	Preparat Promega	Konferencja GM2010	Określany jako luminometr wielomodowy czytnika płytek
Lipofektamina 2000	Thermo Fisher Naukowy	11668019	Kationowy odczynnik do transfekcji lipidów
Opti-MEM	Thermo Fisher Naukowy	31985070	Zmniejszona pożywka w surowicy

TGL powiedział: