Metoda mikromiareczkowania na płytkach do oceny minimalnego stężenia hamującego antybiotyku

Streszczenie

Źródło: Ketelboeter, L. M., et al. Metody hamowania produkcji pyomelaniny bakteryjnej i określania odpowiedniego wzrostu wrażliwości na stres oksydacyjny. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film demonstruje metodę opartą na płytkach mikromiareczkowych do określania minimalnego stężenia hamującego (MIC) testowych antybiotyków przeciwko bakteriom. Po dodaniu zawiesiny patogenu bakteryjnego Pseudomonas aeruginosa do płytki mikromiareczkowej zawierającej seryjne rozcieńczenia badanego antybiotyku i inhibitora wytwarzania pyomelaniny przez bakterie, mierzy się gęstość optyczną studzienek w celu obliczenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyku oraz wpływu inhibitora produkcji pyomelaniny na wrażliwość bakterii na antybiotyki.

Protokół

1. Test minimalnego stężenia hamującego antybiotyku (MIC) na płytkach 96-dołkowych

1. Założyć nocne hodowle szczepów, które mają być testowane w LB (Luria-Bertani) z i bez NTBC (2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion).
   nuta: Protokół ten jest opisany przy użyciu reprezentatywnego poziomu 300 μM NTBC.
   1. Dodać 300 μM NTBC do 2 ml LB. Dodać równoważną objętość nośnika (dimetylosulfotlenku, DMSO) do 2 ml LB dla stanu braku NTBC.
   2. Za pomocą sterylnych wykałaczek zaszczep probówki jedną izolowaną kolonią bakterii. Dla każdego szczepu będzie jedna kultura z NTBC i jedna kultura bez NTBC. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem za pomocą rotatora do hodowli tkankowych w inkubatorze powietrznym.
2. Następnego dnia wykonaj główne roztwory LB + NTBC i LB + DMSO w celu skonfigurowania testu MIC. Dodać NTBC w stężeniu 600 μM, ponieważ zostanie on rozcieńczony dwukrotnie po dodaniu inokulum, uzyskując końcowe stężenie 300 μM.
   1. Aby przetestować jeden antybiotyk dla jednego szczepu, dodaj 600 μM NTBC do 2 ml LB i wymieszaj, aby uzyskać roztwór główny NTBC. Dodać równoważną objętość nośnika (DMSO) do 2 ml LB i wymieszać, aby uzyskać roztwór główny NTBC. Użyj tych roztworów do tworzenia roztworów podstawowych antybiotyków, a także do ustawiania serii rozcieńczeń na płytkach 96-dołkowych.
      nuta: Receptury roztworów wzorcowych dostarczą dodatkowych roztworów, które uwzględnią błędy pipetowania. Roztwory główne można skalować w górę lub w dół w zależności od potrzeb, w zależności od liczby testowanych antybiotyków i szczepów.
3. Przygotować roztwory antybiotyków w roztworach głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
   nuta: Stężenie antybiotyku w tych roztworach powinno być dwukrotnie wyższe od końcowego pożądanego stężenia. Należy przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby przenieść 100 μl do czterech dołków w 96-dołkowej płytce.
   1. Przygotować roztwór podstawowy gentamycyny +/- NTBC o stężeniu 64 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 0,288 μl bulionu gentamycyny (100 mg/ml) do 450 μl LB + NTBC lub LB + DMSO roztwór główny.
      UWAGA: Maksymalne stężenie gentamycyny dla Pseudomonas aeruginosa PAO1 wynosi 32 μg/ml.
   2. Przygotować roztwór podstawowy kanamycyny +/- NTBC o stężeniu 256 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 3,84 μl wywaru kanamycyny (30 mg/ml) do 450 μl roztworów głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
      nuta: Maksymalne stężenie kanamycyny dla P. aeruginosa PAO1 wynosi 128 μg/ml.
   3. Przygotować roztwór podstawowy tobramycyny +/- NTBC o stężeniu 8 μg/ml. Aby przygotować ten roztwór, dodaj 0,36 μl tobramycyny (10 mg/ml) do 450 μl roztworów głównych LB + NTBC lub LB + DMSO.
      nuta: Dla P. aeruginosa PAO1 maksymalne stężenie tobramycyny wynosi 4 μg/ml.
      nuta: Antybiotyki i ich stężenia można dostosować do badanych bakterii.
4. Dodaj 100 μl każdego 2x roztworu antybiotyku do czterech dołków w 96-dołkowej płytce. Umieść te roztwory w rzędzie A. Na przykład gentamycyna powinna być umieszczona w A1 do A4, kanamycyna powinna być umieszczona w A5 do A8, a tobramycyna powinna być umieszczona w A9 do A12. Rysunek 1A przedstawia schemat konfiguracji płytki 96-dołkowej.
   nuta: Na jednej płytce można testować wiele antybiotyków, ale tylko jeden szczep powinien być testowany na jednej płytce, aby wyeliminować możliwość zanieczyszczenia krzyżowego przez inne szczepy.
5. Dodać 50 μl roztworu głównego LB + NTBC lub LB + DMSO do rzędów od B do H płytki 96-dołkowej. Upewnij się, że jedna tabliczka to LB + NTBC, a jedna płyta to LB + DMSO. Zobacz rysunek 1A.
   1. Użyj LB + NTBC dla antybiotyków w LB + NTBC. Użyj LB + DMSO dla antybiotyków w LB + DMSO.
6. Za pomocą mikropipety wykonać dwukrotne seryjne rozcieńczenia antybiotyków, przenosząc 50 μl roztworu z rzędu A do rzędu B. Wymieszać roztwór, zmienić końcówki pipet i przenieść 50 μl roztworu z rzędu B do rzędu C. Powtórzyć dla pozostałych rzędów. Po rozcieńczeniu rzędu G usunąć 50 μl roztworu z tego rzędu i wyrzucić. Użyj rzędu H jako bezantybiotykowej kontroli wzrostu bakterii. Patrz rysunek 1B.
   UWAGA: Każda studzienka w rzędach od A do G zawiera teraz 50 μl antybiotyku w LB + NTBC lub LB + DMSO w stężeniu 2X wyższym niż końcowe pożądane stężenie. Rząd H zawiera LB + NTBC lub LB + DMSO bez antybiotyków.
7. Zmierz OD₆₀₀ kultur z nocy. Umyj wszystkie kultury przed wykonaniem odczytów OD₆₀₀, aby wyeliminować pyomelaninę obecną w pożywce.
   1. Umyć kultury przez odwirowanie 1 ml kultury w mikrowirówce o sile 16 000 x g przez 2 minuty. Usunąć supernatant za pomocą mikropipetora i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml LB.
8. Rozcieńczyć nocne kultury do 2,75x10⁵ jtk/ml w LB.
   nuta: Załóżmy, że jedna jednostka OD₆₀₀ jest odpowiednikiem 1x10⁹ CFU/ml dla P. aeruginosa. Konwersje OD do CFU/ml mogą być różne u innych bakterii.
9. Dodać 50 μl rozcieńczonej kultury bakteryjnej do odpowiedniego dołka.
   nuta: Kultury wyhodowane w NTBC powinny być dodane do studzienek zawierających NTBC, a kultury wyhodowane w DMSO powinny być dodane do studzienek zawierających DMBO. Zobacz rysunek 1B.
   1. Dodaj bakterie do trzech studzienek dla każdego szczepu i stężenia antybiotyku. Dodać 50 μl LB do czwartej studzienki, aby działała jako kontrola zanieczyszczenia bakteryjnego. Zobacz rysunek 1B.
   2. Użyj wielokanałowego mikropipetora do zaszczepienia studzienek. Upewnij się, że końcówki pipet znajdują się blisko dna studzienek podczas dodawania inokulum, aby zapobiec zanieczyszczeniu sąsiednich studzienek.
      nuta: Dodanie kultury bakteryjnej do studzienek spowoduje dwukrotne rozcieńczenie stężenia antybiotyku i NTBC.
10. Przykryć 96-dołkowe płytki parafilmem i inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 37 °C. Inkubować 96-dołkowe płytki statycznie w inkubatorze powietrznym.
11. Sprawdź płytki pod kątem rozwoju bakterii w studzienkach. MIC to najniższe stężenie antybiotyku, w którym nie obserwuje się wzrostu bakterii dla wszystkich trzech kontrprób każdego szczepu.
    1. Zbadaj wzrokowo płytkę pod kątem wzrostu lub odczytaj za pomocą czytnika płytek ustawionego na OD₆₀₀.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat zestawu 96-dołkowych płytek do oznaczania metodą MIC antybiotyku. (A) 100 μl 2x antybiotyków o najwyższym stężeniu początkowym znajduje się w rzędzie A. Rzędy od B do H wypełnia się 50 μl LB + NTBC lub LB + DMSO bez antybiotyków. (B) Dwukrotne seryjne rozcieńczenia przeprowadza się w rzędach od A do G, w wyniku czego w każdym dołk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-[2-nitro-4-(trifluorometylo)benzoilo]-1,3-cykloheksanodion (NTBC)	Sigma-Aldrich	SML0269-50mg	Nazywany również nityzynonem. Rozpuszczalny w DMSO.
H2O2	Sigma-Aldrich	216763-100ML	30 % wag. w H2O. Ustabilizowany.
Gentamycyna	Złota biografia	G-400-100	Rozpuszczalny w H2O. Filtr sterylizować.
Kanamycyna	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP906-5	Rozpuszczalny w H2O. Filtr sterylizować.
Tobramycyna	Sigma-Aldrich	T4014-100MG	Rozpuszczalny w H2O. Filtr sterylizować.