1. Produkcja cienkich dwuwarstwowych hydrożeli poliakrylamidowych (PA) na płytkach wielodołkowych
- Produkcja hydrożelu poliakrylamidowego
nuta: Zobacz rysunek 1.
- Przygotować roztwory wodne, które zawierają 3 - 10% z 40% podstawowego roztworu akrylamidu (patrz tabela materiałów) i 0,06 - 0,6% 2% podstawowego roztworu bis-akryloamidu (patrz tabela materiałów) do produkcji hydrożeli o regulowanej sztywności w zakresie od 0,6 kPa do 70 kPa. Patrz tabela 1.
- W przypadku hydrożeli o natężeniu 0,6 kPa należy zmieszać 3% akrylamidu z 0,045% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 3 kPa zmieszać 5% akrylamidu z 0,074% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 10 kPa należy zmieszać 10% akrylamidu z 0,075% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 20 kPa zmieszać 8% akrylamidu z 0,195% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 70 kPa zmieszać 10% akrylamidu z 0,45% bis-akrylamidem.
UWAGA: Więcej szczegółów na temat osiągania pożądanej sztywności hydrożelu PA można znaleźć w innym miejscu.
- Przygotuj dwa roztwory wodne dla każdej pożądanej sztywności hydrożelu. Przygotuj roztwór 1 tak, aby był wolny od kulek, a roztwór 2 zawierał 0,03% fluorescencyjnych mikrokulek o średnicy 0,1 μm (patrz tabela materiałów).
- Roztwory Degas 1 i 2 przez próżnię przez 15 minut w celu wyeliminowania tlenu, o którym wiadomo, że hamuje polimeryzację roztworów.
- Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu 1, aby umożliwić inicjację polimeryzacji. Działaj szybko.
- Dodaj 3,6 μl roztworu 1 do środka każdego dołka 24-dołkowego naczynia.
- Natychmiast przykryj studzienki 12-milimetrowymi, nieobrobionymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw roztwór 1 na 20 minut, aby w pełni się spolimeryzował.
- Delikatnie postukać igłą strzykawki w powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk na jej końcu, ułatwiający usunięcie szkiełek nakrywkowych. Podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej.
- Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% TEMED do roztworu 2. Umieść 2,4 μl mieszaniny na wierzchu pierwszej warstwy w każdym dołku 24-dołkowego naczynia.
- Przykryj roztwór 2 okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm, delikatnie dociskając w dół za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że grubość drugiej warstwy jest minimalna. Pozwól roztworowi 2 polimeryzować przez 20 minut.
- Dodać 500 μl 50 mM HEPES pH 7,5 do każdej z studzienek, a następnie usunąć szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej i kleszczyków.
- Sterylizacja, powlekanie kolagenem i równoważenie hydrożeli poliakrylamidowych
- Hydrożele należy wystawić na działanie promieni UV przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych, aby umożliwić sterylizację.
- Przygotować mieszaninę 0,5% wagowo-objętościowej 6-(4′-azydo-2′-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH, patrz tabela materiałów) w 1% DMSO i 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Dodać 200 μl tego roztworu na górną powierzchnię hydrożeli. Działając szybko, wystaw je na działanie promieniowania UV (302 nm) przez 10 minut, aby je aktywować.
- Umyj hydrożele dwukrotnie 1 ml 50 mM HEPES pH = 7,5. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że nadmiar środka sieciującego został usunięty.
- Hydrożele pokryć białkowymi 200 μl kolagenu I z ogona szczura 0,25 mg / ml (patrz tabela materiałów) w 50 mM HEPES. Inkubować hydrożele z roztworem kolagenu na wierzchu przez noc w temperaturze pokojowej.
nuta: Aby zapobiec odwodnieniu/odparowaniu, należy umieścić płytki wielodołkowe w wtórnym zbiorniku i dodać laboratoryjne chusteczki czyszczące nasączone wodą na wewnętrznym obrzeżu pojemnika .
- Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z obiektywem 40X, aby zmierzyć grubość hydrożeli. W tym celu należy zlokalizować pozycje z dolnej (gdzie znajduje się powierzchnia szkła) i górne płaszczyzny hydrożelu (gdzie intensywność kulek fluorescencyjnych jest maksymalna). Następnie odejmij pozycje z, aby określić wysokość.
nuta: Do pomiaru grubości hydrożeli użyliśmy odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego i obiektywu 40X z aperturą numeryczną 0,65. W tym miejscu można również wykonać pomiary za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), aby potwierdzić dokładną sztywność hydrożeli (patrz rysunek 2).
- Przed wysiewem komórek będących przedmiotem zainteresowania na hydrożelach, dodać 1 ml pożywki do hydrożeli i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut do 1 godziny, aby zapewnić równowagę.
nuta: Dodaliśmy pełną pożywkę MCDB-131, ponieważ jest to pożywka, w której hodowano modelowe komórki gospodarza (HMEC-1) (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 2.1).
2. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego i wysiewanie na hydrożelach
- Hodowla komórek HMEC-1 (ludzkiego, mikronaczyniowego śródbłonka) w pełnych pożywkach MCDB-131 zawierających pożywkę MCDB-131 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 1 μg/ml hydrokortyzonu i 2 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
- Dzieląc zlewające się kultury 1:6 co 3 - 4 dni i utrzymuj komórki do pasażu 40.
- Dzień przed eksperymentem odłącz komórki od naczynia hodowlanego, używając 0,25% trypsyny/EDTA. Najpierw umyć komórki i ich naczynie hodowlane 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), a następnie dodać odpowiednią ilość 0,25% trypsyny/EDTA (2 ml na 100-milimetrowe naczynie lub 75-milimetrową kolbę, 1 ml na 60-milimetrową szalkę lub 25-centymetrową kolbę), inkubując kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut, aby umożliwić oderwanie komórek od substratu.
- Zneutralizuj trypsynę, dodając żądaną objętość pełnej pożywki MCDB-131, delikatnie pipetować, aby rozbić grudki komórek, a następnie umieść roztwór w stożkowej probówce wirówkowej.
- Delikatnie zamieszaj roztwór komórek, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone, a następnie wyjmij 20 μl roztworu i bardzo delikatnie wypełnij dwie komory pod szkiełkiem nakrywkowym szklanego hemocytometru.
- Roztwór komórek zawartych w stożkowej probówce wirówkowej osadzać za pomocą wirowania przez 10 minut przy 500 x g.
- Podczas 10-minutowego okresu oczekiwania policz komórki za pomocą hemocytometru. Użyj mikroskopu, skup się na liniach siatki hemocytometru za pomocą obiektywu 10X, a następnie użyj ręcznego licznika wyników, aby policzyć liczbę komórek w jednym kwadracie o wymiarach 1 mm x 1 mm.
- Przenieś hemocytometr na inny kwadrat o wymiarach 1 mm x 1 mm, policz tam komórki, a następnie powtórz proces jeszcze dwa razy. Oblicz średnią z czterech pomiarów, a następnie pomnóż średnią przez 104. Wartość końcowa to liczba żywotnych komórek/ml w odwirowywanej zawiesinie komórek.
- Usuń ciecz ze stożkowej probówki wirówkowej, upewniając się, że osad komórkowy nie jest uszkodzony. Ponownie zawiesić komórki w pełnym pożywce MCDB-131 w stężeniu 4 x 105 komórek/ml.
- Wysiewać komórki w zawiesinie na hydrożelach, najpierw usuwając pożywkę, z którą inkubowano hydrożele, a następnie dodając 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego hydrożelu.
3. Zakażenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego L. monocytogenes
- Trzy dni przed zakażeniem należy wytrzepać szczep Lm do użycia z glicerolu (przechowywanego w temperaturze -80 °C) na płytkę z agarem BHI, która zawiera 7,5 μg/ml chloramfenikolu i 200 μg/ml streptomycyny, jeśli to konieczne.
nuta: Szczep, który ma zostać wycięty, może być typu dzikiego lub zmutowanego, konstytutywnie wyrażającego fluorescencję (do barwienia immunologicznego, JAT1045 użyto) lub wyrażającego fluorescencję pod promotorem ActA (do cytometrii przepływowej lub mikroskopii sił trakcyjnych zastosowano JAT983 lub JAT985).
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C aż do powstania oddzielnych kolonii (1-2 dni).
- Dzień przed infekcją wyhoduj pożądaną odmianę przez noc, potrząsając nią z prędkością 150 obr./min w temperaturze 30 °C w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne).
- Umieścić 5 ml pożywki BHI w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne), a następnie zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnej końcówki o pojemności 10 μl.
- Następnego dnia, tuż przed zakażeniem, zmierzyć gęstość optyczną roztworu bakterii przy długości fali 600 nm (OD600), rozcieńczając próbkę w stosunku 1:5; użyć kuwety zawierającej sam BHI, która posłuży jako ślepa próba.
- Rozcieńczyć kulturę przez noc do OD600 0,1 i inkubować ją, wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to właściwe), aby umożliwić bakteriom osiągnięcie wzrostu w fazie logarytmicznej.
- Zmierz OD600 w roztworze bakteryjnym, który powinien wynosić około 0,2 - 0,3. Jeśli OD600 jest wyższy, rozcieńczyć go do 0,2 - 0,3 samym BHI.
- Weź 1 ml roztworu bakteryjnego do probówki mikrowirówkowej. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g, wirując w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS klasy tkankowej do hodowli tkankowej, w kapturze do hodowli tkankowych. Umyj bakterie jeszcze dwukrotnie, wirując je przez 4 minuty w temperaturze 2,000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 1 ml PBS.
- Przygotować mieszaninę infekcyjną, mieszając 10 lub 50 μl bakterii zawieszonych w PBS z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 dla wielu infekcji (MOI; tj. liczba bakterii na komórkę gospodarza) około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza.
- Usuń pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie naruszyć hydrożeli lub komórek. Umyj komórki 1x 1 ml pełnego podłoża MCDB-131, a następnie dodaj 1 ml bakterii do każdej studzienki.
- Przykryj talerz pokrywką i owiń talerze folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 minut przy 200 x g, aby zsynchronizować inwazję. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować je przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Umyj próbki 4x pełną pożywką MCDB-131 i przenieś je do inkubatora do kultur tkankowych. Po upływie dodatkowych 30 minut należy zastąpić pożywkę pożywką uzupełnioną o 20 μg/ml gentamycyny.
4. Cytometria przepływowa do ilościowego określania sztywności matrycy zewnątrzkomórkowej zależnej od podatności komórek gospodarza na infekcje
- Odważyć 5 mg kolagenazy i umieścić ją w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml 0,25% trypsyny-EDTA i dobrze je wymieszaj.
- 8 godzin po zakażeniu usunąć pożywkę z dołków płytki 24-dołkowej i umyć studzienki 1x kulturą tkankową PBS. Wyjmij PBS z dołków i dodaj 200 μl mieszanki trypsyny-EDTA/kolagenazy do każdej studzienki. Umieść go w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, aby umożliwić całkowite odłączenie komórek.
- Użyj świeżej pipety do każdego dołka i odpipetuj mieszaninę w górę iw dół 8 razy. Bądź delikatny, aby nie uszkodzić komórek. Dodaj 200 μl pełnej pożywki do każdego dołka, aby zneutralizować trypsynę.
- Przenieś 400-μl roztworu komórkowego z każdej studzienki do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml z nasadką sitową o wielkości 35 μm (patrz tabela materiałów).
- Analizuj 10 000 - 20 000 komórek na próbkę za pomocą cytometrii przepływowej. Wykonaj akwizycję danych za pomocą cytometrii przepływowej i określ procent zainfekowanych komórek w studzience za pomocą odpowiedniego dostępnego na rynku oprogramowania. Użyj wykresów punktowych do przodu i bocznych wykresów punktowych, aby zabramować większość rozkładu liczby komórek.
UWAGA:: Zapewni to analizę pojedynczych komórek i wyeliminuje szczątki lub dublety lub tryplety komórek.
- Zmierz sygnał fluorescencji z komórek kontrolnych niezakażonych i przeprowadź bramkę populacji zakażonych komórek z wyłączeniem autofluorescencji.
Tabela 1. Skład hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. W tej tabeli w różnych kolumnach podano procentową zawartość 40% roztworu akryloamidu i zawartość procentową 2% roztworu bis-akryloamidu w celu uzyskania danej sztywności (moduł Younga, E).
pkt.
pkt.
pkt.
Rozdział
pkt.
| Moduł Younga (E, kPa) | Akrylamid % (z 40% magazynu) | Bisakryloamid % (z 2% zapasu) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
