1. Produkcja cienkich dwuwarstwowych hydrożeli poliakrylamidowych (PA) na płytkach wielodołkowych
- Rozpuścić nadsiarczan amonu (APS) w destylowanej ultraczystej wodzie, aby osiągnąć końcowe stężenie 10 g/ml. Podwielokrotność roztworu należy podać i przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania (3 tygodnie).
UWAGA: Powyższy roztwór można przygotować przed wytworzeniem hydrożelu.
- Aktywacja szkła w naczyniach 24-dołkowych
- Inkubować 24-dołkowe szklane płytki denne z dołkami o średnicy 13 mm (patrz tabela materiałów) przez 1 godzinę z 500 μl 2 M wodorotlenku sodu (NaOH) na basenik w temperaturze pokojowej.
- Przepłukać studzienki 1x ultraczystą wodą, a następnie dodać 500 μL 2% (3-aminopropylo) trietoksysilanu (patrz Tabela Materiałów) w 95% etanolu do każdej studzienki przez 5 minut.
- Przepłukać studzienki 1x ponownie wodą i dodać 500 μl 0,5% aldehydu glutarowego do każdej studzienki przez 30 min. Przepłukać studzienki 1x wodą i wysuszyć je w temperaturze 60 °C bez pokrywy.
- Produkcja hydrożelu poliakrylamidowego
UWAGA: Patrz rysunek 1.
- Przygotować roztwory wodne, które zawierają 3 - 10% z 40% podstawowego roztworu akrylamidu (patrz tabela materiałów) i 0,06 - 0,6% 2% podstawowego roztworu bis-akryloamidu (patrz tabela materiałów) do produkcji hydrożeli o regulowanej sztywności w zakresie od 0,6 kPa do 70 kPa. Patrz tabela 1.
- W przypadku hydrożeli o natężeniu 0,6 kPa należy zmieszać 3% akrylamidu z 0,045% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 3 kPa zmieszać 5% akrylamidu z 0,074% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 10 kPa należy zmieszać 10% akrylamidu z 0,075% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o natężeniu 20 kPa zmieszać 8% akrylamidu z 0,195% bis-akrylamidem. W przypadku hydrożeli o ciśnieniu 70 kPa zmieszać 10% akrylamidu z 0,45% bis-akrylamidem.
UWAGA: Więcej szczegółów na temat osiągania pożądanej sztywności hydrożelu PA można znaleźć w innym miejscu.
- Przygotuj dwa roztwory wodne dla każdej pożądanej sztywności hydrożelu. Przygotuj roztwór 1 tak, aby był wolny od kulek, a roztwór 2 zawierał 0,03% fluorescencyjnych mikrokulek o średnicy 0,1 μm (patrz tabela materiałów).
- Roztwory Degas 1 i 2 przez próżnię przez 15 minut w celu wyeliminowania tlenu, o którym wiadomo, że hamuje polimeryzację roztworów.
- Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) do roztworu 1, aby umożliwić inicjację polimeryzacji. Działaj szybko.
- Dodać 3,6 μl roztworu 1 do środka każdego dołka 24-dołkowego naczynia (patrz krok 1.2 w celu jego przygotowania).
- Natychmiast przykryj studzienki 12-milimetrowymi, nieobrobionymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi i pozostaw roztwór 1 na 20 minut, aby w pełni się spolimeryzował.
- Delikatnie postukać igłą strzykawki w powierzchnię, aby utworzyć mały haczyk na jej końcu, ułatwiający usunięcie szkiełek nakrywkowych. Podnieść szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej.
- Dodać 0,6% podstawowego roztworu APS o stężeniu 10 g/ml i 0,43% TEMED do roztworu 2. Umieść 2,4 μl mieszaniny na wierzchu pierwszej warstwy w każdym dołku 24-dołkowego naczynia.
- Przykryj roztwór 2 okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 12 mm, delikatnie dociskając w dół za pomocą kleszczy, aby upewnić się, że grubość drugiej warstwy jest minimalna. Pozwól roztworowi 2 polimeryzować przez 20 minut.
- Dodać 500 μl 50 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) o pH 7,5 do każdej z studzienek, a następnie usunąć szklane szkiełka nakrywkowe za pomocą igły strzykawkowej i kleszczy.
- Sterylizacja, powlekanie kolagenem i równoważenie hydrożeli poliakrylamidowych
- Hydrożele należy wystawić na działanie promieni UV przez 1 godzinę w kapturze do hodowli tkankowych, aby umożliwić sterylizację.
- Przygotować mieszaninę 0,5% wagowo-objętościowo 6-(4′-azydo-2′-nitrofenyloamino)heksanianu sulfosukcynimidylu (Sulfo-SANPAH, patrz tabela materiałów) w 1% dimetylosulfotlenku (DMSO) i 50 mM HEPES pH = 7,5.
- Dodać 200 μl tego roztworu na górną powierzchnię hydrożeli. Działając szybko, wystaw je na działanie promieniowania UV (302 nm) przez 10 minut, aby je aktywować.
- Umyj hydrożele dwukrotnie 1 ml 50 mM HEPES pH = 7,5. W razie potrzeby powtórz czynność, aby upewnić się, że nadmiar środka sieciującego został usunięty.
- Hydrożele pokryć białkowymi 200 μl kolagenu I z ogona szczura 0,25 mg / ml (patrz tabela materiałów) w 50 mM HEPES. Inkubować hydrożele z roztworem kolagenu na wierzchu przez noc w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Aby zapobiec odwodnieniu/parowaniu, należy umieścić płytki wielodołkowe w wtórnym zbiorniku i dodać laboratoryjne chusteczki czyszczące nasączone wodą na wewnętrznym obrzeżu obudowy.
- Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego lub konfokalnego z obiektywem 40X, aby zmierzyć grubość hydrożeli. W tym celu należy zlokalizować pozycje z dolnej (gdzie znajduje się powierzchnia szkła) i górne płaszczyzny hydrożelu (gdzie intensywność kulek fluorescencyjnych jest maksymalna). Następnie odejmij pozycje z, aby określić wysokość.
UWAGA: Do pomiaru grubości hydrożeli użyliśmy odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego i obiektywu 40X z aperturą numeryczną 0,65. W tym miejscu można również wykonać pomiary za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), aby potwierdzić dokładną sztywność hydrożeli (patrz rysunek 2).
- Przed wysiewem komórek będących przedmiotem zainteresowania na hydrożelach, dodać 1 ml pożywki do hydrożeli i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut do 1 godziny, aby zapewnić równowagę.
UWAGA: Dodaliśmy pełną pożywkę MCDB-131, ponieważ jest to pożywka, w której hodowano modelowe komórki gospodarza (HMEC-1) (szczegółowe informacje można znaleźć w kroku 2.1).
2. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego i wysiewanie na hydrożelach
- Hodowla komórek HMEC-1 (ludzkiego, mikronaczyniowego śródbłonka) w pełnych pożywkach MCDB-131 zawierających pożywkę MCDB-131 uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu, 1 μg/ml hydrokortyzonu i 2 mM L-glutaminy (patrz tabela materiałów).
- Podziel zlewające się kultury 1:6 co 3-4 dni i utrzymuj komórki do przejścia 40.
- Dzień przed eksperymentem odłącz komórki od naczynia hodowlanego, używając 0,25% trypsyny/EDTA. Najpierw umyć komórki i ich naczynie hodowlane 1x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodać odpowiednią ilość 0,25% trypsyny/EDTA (2 ml na 100-milimetrową szalkę lub 75-centymetrową kolbę, 1 ml na 60-milimetrową szalkę lub 25-centymetrową kolbę), inkubując kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 - 10 minut, aby umożliwić oderwanie komórek od substratu.
- Zneutralizuj trypsynę, dodając żądaną objętość pełnej pożywki MCDB-131, delikatnie pipetować, aby rozbić grudki komórek, a następnie umieść roztwór w stożkowej probówce wirówkowej.
- Delikatnie zamieszaj roztwór komórek, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone, a następnie wyjmij 20 μl roztworu i bardzo delikatnie wypełnij dwie komory pod szkiełkiem nakrywkowym szklanego hemocytometru.
- Roztwór komórek zawartych w stożkowej probówce wirówkowej osadzać za pomocą wirowania przez 10 minut przy 500 x g.
- Podczas 10-minutowego okresu oczekiwania policz komórki za pomocą hemocytometru. Użyj mikroskopu, skup się na liniach siatki hemocytometru za pomocą obiektywu 10X, a następnie użyj ręcznego licznika wyników, aby policzyć liczbę komórek w jednym kwadracie o wymiarach 1 mm x 1 mm.
- Przenieś hemocytometr na inny kwadrat o wymiarach 1 mm x 1 mm, policz tam komórki, a następnie powtórz proces jeszcze dwa razy. Oblicz średnią z czterech pomiarów, a następnie pomnóż średnią przez 104. Wartość końcowa to liczba żywotnych komórek/ml w odwirowywanej zawiesinie komórek.
- Usuń ciecz ze stożkowej probówki wirówkowej, upewniając się, że osad komórkowy nie jest uszkodzony. Ponownie zawiesić komórki w pełnym pożywce MCDB-131 w stężeniu 4 x 105 komórek/ml.
- Wysiewać komórki w zawiesinie na hydrożelach, najpierw usuwając pożywkę, z którą inkubowano hydrożele, a następnie dodając 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego hydrożelu.
3. Zakażenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego Listeria monocytogenes (Lm)
- Przygotowanie wstępne
UWAGA: Przygotuj wcześniej następujące roztwory.
- Zapasy streptomycyny, chloramfenikolu i gentamycyny
- Przygotować 50 mg/ml roztworów podstawowych streptomycyny, ważąc 0,5 g siarczanu streptomycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml ultraczystej wody.
- Przygotować 7,5 mg/ml roztworów podstawowych chloramfenikolu, ważąc 75 mg chloramfenikolu i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml 100% etanolu.
- Przygotować 20 mg/ml roztworów podstawowych gentamycyny, ważąc 0,2 g siarczanu gentamycyny i rozpuszczając go całkowicie w 10 ml ultraczystej wody.
- Przefiltruj i wysterylizuj wszystkie roztwory podstawowe za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i przechowuj je w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania (1 - 2 miesiące).
- Pożywki do infuzji mózgu i serca (BHI) i płytki agarowe
- Zlokalizuj dwie kolby o pojemności 1 litra i dodaj mieszadło magnetyczne do każdej kolby.
- W przypadku pożywki BHI dodać 37 g proszku BHI do jednej kolby i dodać ultraczystą wodę do 1 l. Energicznie wymieszać roztwór, umieszczając kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aż proszek się rozpuści.
- W przypadku płytek agarowych BHI dodać 37 g proszku BHI i 15 g granulowanego agaru (patrz Tabela Materiałów) do drugiej kolby i dodać ultraczystą wodę do objętości 1 l. Energicznie wymieszać roztwór, umieszczając kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aż proszek się rozpuści.
- Niezbyt mocno zakręcić pokrywki kolb i autoklawować roztwory przy użyciu ustawienia płynu lub zgodnie ze specyfikacją autoklawu.
- Usunąć roztwór z autoklawu, a następnie schłodzić roztwór agaru-BHI do temperatury 55 °C. Jeśli pożywka BHI w kolbie o pojemności 1 l jest utrzymywana w sterylnej formie, może być używana przez okres do miesiąca.
- Aby przygotować płytki z agarem i agarem bakterii, należy najpierw dodać antybiotyki, jeśli to właściwe, do kolby zawierającej BHI i agar (w zależności od szczepów bakterii, które mają być hodowane). Na krótko umieścić kolbę na magnetycznej płytce mieszającej, aby umożliwić szybkie wymieszanie.
UWAGA: Stosowane tutaj antybiotyki są specyficzne dla zastosowanych szczepów LM, ale wszelkie niezbędne antybiotyki mogą być stosowane w płytkach BHI-agar. Dodaliśmy streptomycynę do stężenia 200 μg/ml i chloramfenikol do stężenia 7,5 μg/ml, ponieważ szczepy 10403S Lm są odporne na streptomycynę. Szczepy te zostały sprzężone z plazmidem, który zawiera otwartą ramkę odczytu acetylotransferazy chloramfenikolu, stąd odporność na chloramfenikol.
- Wlej mieszaninę do 10-centymetrowych płytek do hodowli bakterii polistyrenowych (około 20 ml na płytkę). Aby pozbyć się pęcherzyków, krótko podpal górną powierzchnię płytek. Schłodzić talerze przez noc w temperaturze pokojowej.
- Następnego dnia zamknąć suche płytki i przechowywać je w temperaturze 4 °C.
- Zakażenie ludzkich komórek śródbłonka mikronaczyniowego L. monocytogenes
- Trzy dni przed zakażeniem należy wytrzepać szczep Lm do użycia z glicerolu (przechowywanego w temperaturze -80 °C) na płytkę z agarem BHI, która zawiera 7,5 μg/ml chloramfenikolu i 200 μg/ml streptomycyny, jeśli to konieczne.
UWAGA: Szczep, który ma zostać odcięty, może być typu dzikiego lub zmutowanego, konstytutywnie wyrażającego fluorescencję (do barwienia immunologicznego, JAT1045 użyto) lub wyrażającego fluorescencję pod promotorem ActA (do cytometrii przepływowej lub mikroskopii sił trakcyjnych zastosowano JAT983 lub JAT985).
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C aż do powstania oddzielnych kolonii (1-2 dni).
- Dzień przed infekcją wyhoduj pożądaną odmianę przez noc, potrząsając nią z prędkością 150 obr./min w temperaturze 30 °C w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne).
- Umieścić 5 ml pożywki BHI w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to konieczne), a następnie zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki agarowej za pomocą sterylnej końcówki o pojemności 10 μl.
- Następnego dnia, tuż przed zakażeniem, zmierzyć gęstość optyczną roztworu bakterii przy długości fali 600 nm (OD600), rozcieńczając próbkę w stosunku 1:5; użyć kuwety zawierającej sam BHI, która posłuży jako ślepa próba.
- Rozcieńczyć kulturę przez noc do OD600 0,1 i inkubować ją, wstrząsając przez 2 godziny w temperaturze 30 °C, w pożywce BHI z 7,5 μg/ml chloramfenikolu (jeśli to właściwe), aby umożliwić bakteriom osiągnięcie wzrostu w fazie logarytmicznej.
- Zmierz OD600 w roztworze bakteryjnym, który ma wynosić około 0,2-0,3. Jeśli OD600 jest wyższy, rozcieńczyć go do 0,2 - 0,3 samym BHI.
- Weź 1 ml roztworu bakteryjnego do probówki mikrowirówkowej. Wirować przez 4 minuty w temperaturze 2 000 x g, wirując w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 1 ml PBS klasy tkankowej do hodowli tkankowej, w kapturze do hodowli tkankowych. Umyj bakterie jeszcze dwukrotnie, wirując je przez 4 minuty w temperaturze 2,000 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 1 ml PBS.
- Przygotować mieszaninę infekcyjną, mieszając 10 lub 50 μl bakterii zawieszonych w PBS z 1 ml pełnej pożywki MCDB-131 dla wielu infekcji (MOI; tj. liczba bakterii na komórkę gospodarza) około 50 bakterii na komórkę gospodarza lub 10 bakterii na komórkę gospodarza.
- Usuń pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek, uważając, aby nie naruszyć hydrożeli lub komórek. Umyj komórki 1x 1 ml pełnego podłoża MCDB-131, a następnie dodaj 1 ml bakterii do każdej studzienki.
- Zachowaj trochę mieszanki infekcyjnej (co najmniej 100 μl) do oznaczenia MOI (patrz krok 3.3).
- Przykryj talerz pokrywką i owiń talerze folią spożywczą z polietylenu, aby uniknąć wycieku. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 minut przy 200 x g, aby zsynchronizować inwazję. Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować je przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
- Umyj próbki 4x pełną pożywką MCDB-131 i przenieś je do inkubatora do kultur tkankowych. Po upływie dodatkowych 30 minut należy zastąpić pożywkę pożywką uzupełnioną o 20 μg/ml gentamycyny.
- Oznaczanie wielości infekcji (MOI)
- Podczas początkowej 30-minutowej inkubacji komórek gospodarza z bakteriami należy przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia mieszanki infekcji w celu określenia MOI. Wykonać 10-krotne rozcieńczenia, mieszając 100 μl mieszanki infekcyjnej z 900 μl 1x PBS (rozcieńczenie 10-1). Następnie zmieszać 100 μl rozcieńczenia 10-1 z 900 μl PBS (rozcieńczenie 10-2).
- Kontynuować aż do uzyskania rozcieńczenia 10-5.
UWAGA: Wszystkie roztwory należy dobrze wymieszać przed ich rozcieńczeniem, a na każdym etapie należy używać świeżych, czystych końcówek do pipet.
- Po rozcieńczeniu umieścić 100 μl rozcieńczeń 10-2 - 10-5 na środku płytki BHI/agar/chloramfenikol/streptomycyna (jeśli to właściwe).
- Zrób rozsiewacz ze szklanej pipety, używając ognia do zgięcia pipety, aby utworzyć haczyk. Zanurz pipetę w 100% etanolu w celu sterylizacji, a następnie spal etanol płomieniem.
- Po ostygnięciu rozsiewacza rozprowadzić jednorodnie rozcieńczenia bakteryjne na płytkach, zaczynając od rozcieńczenia 10-5 i przechodząc do bardziej skoncentrowanych mieszanek. Inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C przez 2 dni.
- W zależności od gęstości kolonii określić liczbę kolonii na płytkach rozcieńczających 10-3 i 10-4 lub 10-4 i 10-5. Oblicz MOI w następujący sposób:
liczba kolonii × współczynnik rozcieńczenia ÷ objętość początkowo dodana = liczba jednostek tworzących kolonie (CFU) na μl
liczba jtk na μl × objętość mieszaniny bakterii na studzienkę = liczba jtk na studzienkę
liczba CFU na studzienkę × objętość komórek w studzience = liczba bakterii na komórkę
UWAGA: CFU oznacza jednostki tworzące kolonie.
- Uśrednij MOI z dwóch płytek, aby uzyskać końcowe MOI.
4. Ilościowa mikroskopia poklatkowa do oceny sztywności matrycy zewnątrzkomórkowej
Przygotuj hydrożele PA na 24-dołkowej płytce (zobacz krok 1), zasiej komórki HMEC-1 (zobacz krok 2) i hoduj przez noc kultury JAT983, jak opisano powyżej (zobacz krok 3).
- W dniu zakażenia należy przygotować mieszankę infekcyjną, mieszając 10 μl osadu bakteryjnego na ml pełnej pożywki MCDB-131. Ostrożnie wyjmij pożywkę z dołków 24-dołkowych płytek i dodaj 1,9 ml pełnej pożywki MCDB-131 i 0,1 ml mieszanki bakteryjnej do każdej studzienki.
UWAGA: Niższy MOI używany w tym teście jest niezbędny do analizy zdarzeń rozprzestrzeniania się, które rozpoczynają się od pojedynczej bakterii atakującej komórkę gospodarza.
- Przykryj płytkę pokrywką i zamknij ją folią, aby uniknąć wycieku. Umieścić płytki w wirówce i wirować próbki przez 10 minut przy 200 x g, aby zsynchronizować inwazję.
- Przenieść płytki do inkubatora do hodowli tkankowych i inkubować je przez 5 minut.
- Umyj próbki 4x pożywką i przenieś je do inkubatora do hodowli tkankowych. Po dodatkowych 5 - 7 minutach zastąp pożywkę pożywką uzupełnioną 20 μg/ml gentamycyny.
- Inkubować płytkę w inkubatorze przez dodatkowe 5 godzin, aby umożliwić promotorowi actA włączenie i sterowanie wyrażeniem otwartej ramki odczytu mTagRFP.
- Przygotuj żywą pożywkę mikroskopową, uzupełniając L-15 Leibovitz 10% płodową surowicą bydlęcą, 10 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu i 1 μg/ml hydrokortyzonu.
UWAGA: L-15 zawiera już 2 mM L-glutaminy, więc nie jest konieczne dodawanie dodatkowego, jak w przypadku pożywki MCDB-131.
- Zmieszaj 1 μl 1 mg/ml barwnika Hoechst z 1 ml pełnej pożywki L-15 i dodaj do każdego dołka, aby zabarwić jądra komórek. Umieścić komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych na 10 minut, a następnie zastąpić w każdym dołku pełne podłoże L-15 1 ml pełnego podłoża L-15 uzupełnionego 20 μg/ml gentamycyny. Przykryj płytkę pokrywką i umieść ją w komorze środowiskowej mikroskopu (patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C.
UWAGA: Do obrazowania użyto odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego z kamerą CCD (patrz tabela materiałów) i obiektywu fluorytowego 20X z planem powietrza o 0,75 NA. Moc została ustawiona na 50%, a czas naświetlania na 50 ms. Filtry mikroskopowe stosowane w mCherry to 470/525 nm odpowiednio dla wzbudzenia i emisji.
- Obraz w wielu pozycjach co 5 minut za pomocą funkcji autofokusa do monitorowania, jak Lm rozprzestrzenia się przez monowarstwy HMEC-1 osadzone na hydrożelach o różnej sztywności.
UWAGA: L-15 jest buforowany HEPES, więc nie jest konieczne stosowanie CO2 podczas obrazowania.
Tabela 1. Skład hydrożeli poliakrylamidowych (PA) o różnej sztywności. W tej tabeli w różnych kolumnach podano procentową zawartość 40% roztworu akryloamidu i zawartość procentową 2% roztworu bis-akryloamidu w celu uzyskania danej sztywności (moduł Younga, E).
pkt.
pkt.
pkt.
Rozdział
pkt.
| Moduł Younga (E, kPa) | Akrylamid % (z 40% magazynu) | Bisakryloamid % (z 2% zapasu) |
| 0,6 | 3 | 0,045 |
| 3 | 5 | 0,075 |
| 10 | 10 | 0,075 |
| 20 | 8 | 0,195 |
| 70 | 10 | 0,45 |
