Określanie skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych za pomocą testu płytki nazębnej

Streszczenie

Źródło: Yadavalli, T., et al. Eksplantat tkanki rogówki świni w celu zbadania skuteczności leków przeciwwirusowych wirusa opryszczki pospolitej-1. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje metodę przeprowadzania testu płytki nazębnej przy użyciu wirusa uzyskanego z zakażonej rogówki świni. Rogówka świni służy do testowania skuteczności przeciwwirusowej leków eksperymentalnych.

Protokół

1. Kwantyfikacja infekcji wirusowych

UWAGA: Miana wirusów z rogówek świń powinny być oceniane codziennie, aby przeanalizować efekt leczenia farmakologicznego.

1. Aby określić ilościowo wirusa, wysiewaj komórki Vero o gęstości 5 x 10⁵ komórek na studzienkę, jeśli używasz płytki 6-dołkowej, jak to miało miejsce w tym eksperymencie. Zrób to dzień przed infekcją. Inkubuj posiałe komórki przez noc, aby upewnić się, że zlewają się w celu ilościowego określenia wirusa.
2. Porcjować 500 μl pożywki bez surowicy do wielu probówek do mikrowirówek. Włóż sterylny wacik z bawełnianą końcówką zanurzony w probówkach wypełnionych pożywką bez surowicy. Waciki bawełniane należy zanurzyć i zwilżyć przez co najmniej 5 minut przed użyciem.
3. Nie naruszając podłoża, należy przetransportować zakażoną płytkę rogówki świni do komory bezpieczeństwa biologicznego. Za pomocą mokrych wacików bawełnianych wykonaj 3 obroty zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 3 obroty przeciwnie do ruchu wskazówek zegara o średnicy 5 mm od środka zainfekowanej rogówki świni bez wywierania nadmiernego nacisku.
4. Włóż bawełniany wacik z powrotem do probówki mikrowirówkowej wypełnionej pożywką bez surowicy i obróć ją 5 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Metalową końcówkę wacika należy przyciąć krótko, aby w całości zmieściła się w probówce mikrowirówki, a pokrywkę można było zamknąć.
5. Umieść probówkę mikrowirówki zawierającą wacikową końcówkę na maszynie do wirowania i wiruj z dużą prędkością przez 1 minutę.
6. Przeprowadzić kwantyfikację wirusa za pomocą testu płytkiowego na tych próbkach.
   nuta: Ten etap oznaczania ilościowego należy przeprowadzić w 2., 4. i opcjonalnie 6 dni po zakażeniu.

2. Kwantyfikacja wirusa za pomocą testu płytki nazębnej

UWAGA: Aby przeprowadzić test płytki, hoduj i płytkuj komórki Vero na 6-dołkowej płytce i upewnij się, że 90% zbieżność komórek przed rozpoczęciem testu. Użyj zlewającej się kolby o długości 75^cm2 tych komórek. Wszystkie poniższe czynności należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Przepłukać zlewającą się monowarstwę komórek Vero w kolbie 10 ml świeżego buforu fosforanowego soli fizjologicznej (PBS) po zaaspirowaniu pożywki hodowlanej. Powtórz etap płukania jeszcze raz z PBS po zassaniu pierwszego zestawu roztworów myjących.
2. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny do monowarstwy komórek. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Gołym okiem upewnić się, że komórki są odłączone od wewnętrznej powierzchni kolby. Jeśli nie, odczekać kolejne 5 minut przed ponownym zbadaniem kolby. Gdy wydaje się, że komórki są odłączone, dodać 9 ml całej pożywki do monowarstwy, aby upewnić się, że komórki całkowicie odsuną się od powierzchni kolby.
3. Zebrać wszystkie komórki z kolby wraz z całą pożywką i umieścić je w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Na każdą studzienkę z 6 dołków, które są używane do oznaczania płytki nazębnej, użyj 300 μl z probówki wirówkowej. Uzupełnić każdą studzienkę płytki 6-dołkowej 2 ml całego podłoża. Pozostaw płytki w inkubatorze na noc, aby mogły rosnąć i utworzyć zlewającą się monowarstwę w każdym dołku.
5. W celu przeprowadzenia testu płytki nazębnej należy przeprowadzić seryjne rozcieńczanie próbek przed określeniem ilościowym wirusa.
6. Przeprowadzić log101-krotne rozcieńczenie wirusa w probówkach do mikrowirówek, używając pożywki bez surowicy, aż do osiągnięcia rozcieńczenia ^10-8. W rozcieńczeniu ^10-3 przenieś 1 ml rozcieńczenia do monowarstwy posianych komórek po zaessaniu pożywki wzrostowej na komórkach z płytki 6-dołkowej, będzie to etap infekcji. Inkubować zakażoną płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
7. Odessać istniejącą pożywkę infekcyjną, dwukrotnie delikatnie przemyć PBS, aby pokryć komórki, i dodać 2 ml pożywki z metylocelulozą na studzienkę do wszystkich 6 dołków. Inkubować przez 72 godziny lub do momentu, gdy będzie można zobaczyć tworzenie się blaszek. Blaszki miażdżycowe można zidentyfikować po tworzeniu się małych przerw między komórkami w monowarstwie komórki.
8. Powoli dodawaj 1 ml metanolu do rogu każdej studzienki, używając ściany jako końcówki prowadzącej. Inkubować 6-dołkową płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Powoli odsysać zawartość każdej studzienki z płytki, nie naruszając ani nie mieszając monowarstwy komórek.
9. Dodaj 1 ml roztworu roboczego fioletu krystalicznego do każdej studzienki 6-dołkowej płytki, upewniając się, że wszystkie komórki są pokryte. Inkubować 6-dołkową płytkę w ciemności przez 30 minut. Wyrzuć roztwór fioletu krystalicznego przez zasysanie go i wysusz studzienki na arkuszu chłonnego papieru.
10. Policz liczbę blaszek w basenie o najwyższym rozcieńczeniu, aby określić ilościowo całkowitą zawartość wirusa w roztworze wyjściowym. Powtórz proces dwukrotnie, aby potwierdzić miano wirusa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igły podskórne 30 G.	Bd	305128
Szklana butelka o pojemności 500 ml.	Thomas Naukowy	844027
Szafa bezpieczeństwa biologicznego z certyfikatem bezpieczeństwa biologicznego Level-2 (BSL-2).	Thermofisher Naukowy	Herasafe 2030i
Calgiswab 6 "Sterylne standardowe waciki z alginianu wapnia.	Puritan	22029501
Skrobak do komórek - 25 cm	Biologix BE	tel. 70-1180 70-1250
probówka wirówkowa
Kryształowy fiolet	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C6158	Przechowywać proszek w ciemnym miejscu
Zmodyfikowane podłoże Eagle's firmy Dulbecco - DMEM	GIBCO (Przedsiębiorstwo GIBCO)	41966029	Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia
etanol	Sigma Aldrich	E7023
Surowica bydlęca płodu -FBS	Sigma Aldrich	F2442	Porcjować do probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w stanie zamrożonym do czasu użycia
Komórki Vero	Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC	CRL-1586
Maszyna wirowa
metanol
Metyloceluloza
Probówka do mikrowirówek
Rogówki świń	Park Packaging Co., Chicago, IL		Specjalne zamówienie na życzenie
Pokrowce na ławki zabiegowe - w razie potrzeby.	Thermofisher Naukowy	S42400
Pipety serologiczne	Thomas Naukowy	P7132, P7127, P7128, P7129, P7137
Sprzęt do pipetowania serologicznego.	Thomas Naukowy	Ezpette Pro
Stereoskop	Carl Zeiss	SteREO Discovery V20
Kolby do hodowli tkankowych, T175 cm2.	Thomas Naukowy	Zobacz materiał T1275
Inkubatory do hodowli tkankowych, które mogą utrzymać 5% CO2 i temperaturę 37 °C	Thermofisher Naukowy	Forma 50145523
Płytki poddane hodowli tkankowej (6-dołkowe).	Thomas Naukowy	Zobacz materiał T1006
trypsyna

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: