1. Szczepy HSV i postępowanie z
nimi
UWAGA: Do testu używa się rekombinowanych, nierozprzestrzeniających się HSV-1(KOS) gL86 i HSV-2 (KOS) 333gJ- z aktywnością reporterową beta-galaktozydazy.
- Użyć wirusa z jednej partii i przechowywać w temperaturze -80 °C w stosunku 1:1 zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i odtłuszczonym mlekiem do czasu użycia. Przed przechowywaniem partii wirusa należy oznaczyć stężenie wirusa za pomocą testu o-nitrofenylo-β-D-galaktopyranozydu (ONPG) i 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopyranozydu (X-Gal).
- Określ żywotność wirusa i wielokrotność infekcji (MOI) przez barwienie X-Gal dla każdego testu eksperymentalnego przeprowadzonego przy użyciu testu wprowadzania wirusa reporterowego, jak opisano wcześniej (Figura 1).
- Rozcieńczyć wirusa (Opt-MEM) do pożądanego MOI. Utrwal monowarstwy (paraformaldehyd; 0,5 ml / studzienkę) przed barwieniem. Umieścić kontrole żywotności wirusa na oddzielnej płytce do mikromiareczkowania równolegle z płytkami do oznaczania wielomikrobiologicznego.
2. Obsługa komórek HeLa 299
- Rośnie w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w DMEM z 4,5 g / L glukozy, 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS), gentamycyny (50 μg / ml) i L-glutaminy. Komórki pasażowe w 80% zbiegu z roztworem trypsyny (kwas etylenodiaminotetraoctowy, 0,53 M EDTA; 0,05% trypsyna; 5 ml / kolbę).
3. Obsługa C. albicans
UWAGA: C. albicans uzyskany z klinicznego źródła laboratoryjnego jest przechowywany w temperaturze -80 °C w odtłuszczonym mleku Remmel 2x medium.
- Hodowla zamrożonego bulionu na pożywce dekstrozy Sabouraud (37 °C). Po 24 godzinach subkultura C. albicans na pożywce Fungisel (37 °C; 48 godzin) do użycia.
- Wytworzyć formy probówki rozrodczej (GT) (pobrać reprezentatywne kolonie; 3 ml FBS; 3 godz.; 37 °C; absorbancja600 (Abs600), 0,3). Po inkubacji przemyć GT (Zbilansowany Roztwór Soli Hanksa, HBSS; 2x; 4,000 x g). Umyty GT dodać do podgrzanego HBSS (37 °C; 0,32 Abs600). Formy GT powinny stanowić 99% obserwowanych komórek, jak określono za pomocą liczby hemocytometrów.
- Przygotuj zawiesiny wyjściowe z drożdży (YF), wybierając reprezentatywne kolonie grzybów (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs600). Policz liczbę form YF / ml pod mikroskopem za pomocą hemocytometru. Formy YF powinny stanowić 99% obserwowanych komórek, jak określono za pomocą liczby hemocytometrów.
- Przygotować roboczy wywar z grzybów (250 μl bulionu GT lub YF w 25 ml HBSS; 37 °C; 105 jednostka tworząca kolonię, (jtk/ml)
4. Obchodzenie się z S. aureus
- Store S. aureus American Type Culture Collection, ATCC 25923 (-80 °C; Mleko odtłuszczone Remmel 2x). Posiew na agarze z krwią owczą (5%; 37 °C; 24 godz.). Zebrać reprezentatywne kolonie i przenieść do pożywki z soli mannitolu w ciągu 2 dni dla stada (37 °C; 18 godzin).
- Zrobić zawiesinę rosołu S. aureus (3 ml HBSS; 1,32 Abs600 ;108 jtk/ml)
- Przygotować wywar roboczy z S. aureus (100 μl bulionu w 25 ml HBSS; 105 CFU/ml).
5. Zawiesiny Candida i S. aureus
- Przygotować mieszaninę zawiesiny C. albicans i S. aureus (250 μl bulionu YF lub GT i 100 μl bulionu S. aureus w 25 ml HBSS).
6. Test biofilmu wielomikrobiologicznego
- Wysiewaj 96-dołkowe płytki z 200 μl 2 x 105 komórek HeLa/ml (85% poziom konfluencji). Płyty skalne (30 - 45 min; 37 °C) przed inkubacją (37 °C; inkubator 5% CO2 ; 18 godz.). Umyj monowarstwy (1x; Opt-MEM), a następnie wysiewaj HSV (HSV-1 (KOS) gL86 lub HSV-2 (KOS) 33 gJ- w 100 μl Opt-MEM ; MOI 50 i 10). Inkubować płytki (3 godz.; 37 °C; 5% CO2 ). Używaj tylko jednego szczepu wirusa dziennie.
- Przemyć zainfekowane monowarstwy (1x; sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) Mg+2 i Ca+2; 100 μl). Zastąp PBS ciepłym HBSS, pozostawiając 25 μl w każdym dołku.
- Dodać zawiesiny robocze YF, GT i/lub S. aureus (100 μl; stosunek docelowy do komórek = 5:1; n = 16), jak wskazano w tabeli 1. Inkubować płytki (statycznie; 30 min; 37 °C; 5% CO2 ).
- Po inkubacji odsysać po jednej kolumnie na raz, natychmiast napełniając 300 μl PBS Mg+2 i Ca+2. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, a następnie dodać bufor do oznaczania radioimmunoprecypitacji (RIPA; filtr sterylizowany; 200 μl rozcieńczenia 1:50).
- Szybko rozcierać lizat komórek HeLa, a następnie umieścić 50 μl na solach mannitolu (MS) i/lub pożywkach grzybowych (F) (ryc. 2). Rozprowadzić lizat za pomocą szklanego pręta wygiętego pod kątem 90°. Inkubować płytki (18 godzin w temperaturze 37 °C). Ręcznie policz liczbę kolonii na płytce. Kontrola polega na przyleganiu S. aureus i/lub C. albicans do komórek HeLa niezakażonych HSV.
Tabela 1. Ogólne oznaczanie szablonowe adhezencji drobnoustrojów w interakcjach wielodrobnoustrojowych.GT = fenotyp rurki zarodkowej Candida albicans; YF = drożdże C. albicans tworzą fenotyp; MSSA = wrażliwy na metycylinę Staphylococcus aureus; MS = sole mannitolu pożywka; F= Podłoże grzybowe.
