$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Rozwiązania i media
- Przygotuj 2X pożywkę Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), bulion dekstrozowy Sabouraud i agar dekstrozowy Sabouraud zgodnie z tabelą 1.
2. Warunki wzrostu inokulum grzybów
- Przechowuj wszystkie szczepy grzybów jako zamrożone zapasy w 35% glicerolu w temperaturze -80 °C, aż będą potrzebne.
- Przed każdym eksperymentem wykonaj następujące czynności.
- Dla szczepów Candida albicans:
- Rozmrozić fiolkę podstawową i przenieść 200 μl do 10 ml bulionu z dekstrozy Sabouraud w sterylnej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml z nakrętką i hodować przez noc w temperaturze 30 °C z mieszaniem (200 obr./min). Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby lepiej napowietrzyć kulturę.
- Dla szczepów Cryptococcus neoformans:
- Zeskrobać zamrożoną powierzchnię fiolki z zapasem. Umieścić komórki na płytkach z agarem z dekstrozą Sabouraud i inkubować przez 48 godzin w temperaturze 30 °C. Po widocznym wzroście wyizolowanych kolonii należy przechowywać płytki w lodówce (4 °C) szczelnie zamkniętej folią parafinową do 15 dni.
- Zebrać średniej wielkości izolowaną kolonię z płytki za pomocą sterylnej wykałaczki lub sterylnej pętli do zaszczepiania i zaszczepić 10 ml bulionu dekstrozowego Sabouraud w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Inkubować przez około 24 godziny w temperaturze 30 °C przy mieszaniu (200 obr./min).
- Nie należy przekraczać 24 godzin inkubacji. Pamiętaj, aby pochylić rurkę i pozostawić nakrętkę lekko uchyloną, aby uzyskać lepszą wentylację. Zawsze dobrze jest ustandaryzować etap wzrostu komórek przed każdym badaniem, ponieważ jest to ważny czynnik wpływający na oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe.
nuta: W naszych eksperymentach oba grzyby były hodowane w temperaturze 30 °C w celu szybkiego rozmnażania, ale temperatura może być zmieniana, aby odzwierciedlić cele badania, na przykład leczenie kliniczne (37 °C). Co najważniejsze, ten początkowy czas inkubacji powinien być ustalony z wyprzedzeniem dla każdego izolatu grzyba i utrzymywany przez wszystkie testy, aby zapewnić odtwarzalność.
- Po wzroście grzybów zebrać komórki, odwirowując stożkowe probówki o stężeniu 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml PBS.
- Ponownie zawiesić komórki i ponownie odwirować przy 1 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Powtórzyć mycie PBS i odwirowanie jeszcze dwa razy. Po trzecim praniu ponownie zawieś komórki w 5 ml (w zależności od wielkości granulki) pożywki 2X RPMI-1640.
- Przygotować 1 ml rozcieńczenia 1:100 lub 1:1 000 w probówce mikrowirówkowej (w zależności od zmętnienia zawiesiny komórek).
- Pobrać 10 μl tego rozcieńczenia, umieścić je w komorze hemocytometru i policzyć całkowitą liczbę komórek w czterech rogowych kwadrantach pod mikroskopem. Obliczyć stężenie według wzoru: (całkowita liczba komórek/4) x współczynnik rozcieńczenia x 10,4 (stała rozcieńczenia komory).
- Rozważ 100% żywotności, jeśli liczba żywotności i warunki wzrostu były systematycznie skorelowane dla badanego izolatu.
nuta: Standaryzacja i kontrola jakości liczby żywotności może być przeprowadzona poprzez posiewanie wsteczne zgodnie z metodą Europejskiego Komitetu ds. Badania Wrażliwości Na Środki Przeciwdrobnoustrojowe (EUCAST) dla drożdży w odniesieniu do minimalnego stężenia hamującego (MIC).
- Jeśli korelacja wzrost/żywotność nie została ustalona dla badanego izolatu, zmierz żywotność grzyba, licząc żywe komórki w hemocytometrze za pomocą barwników, które selektywnie barwią martwe komórki, takich jak floksyna B11, błękit trypanowy lub zieleń Janusa. Używaj komórek grzyba do tego protokołu tylko wtedy, gdy żywotność populacji w tym momencie wynosi 90% lub więcej.
UWAGA: Martwe/żywe barwniki mogą nie działać dobrze z wybranym grzybem. Przetestuj je przed użyciem. Na przykład niebieski barwnik trypanowy nie działa dobrze z C. neoformans.
- Następnie przygotuj zawiesiny komórek w pożywce 2X RPMI-1640 (2X dostosowaną inokulum w pożywce RPMI-1640). W przypadku płytek 96-dołkowych należy rozważyć objętość 5 ml na każdą płytkę.
- Dla wszystkich szczepów C. albicans należy przygotować zawiesinę komórek podstawowych 4 x 103 komórek/ml. Stężenie to wynosi 2 razy więcej niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (2 x 103 komórki / ml).
- W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować podstawową hodowlę komórek 2 x 104 komórek/ml. Stężenie to jest dwukrotnie większe niż końcowe stężenie komórek w każdym dołku (1 x 104 komórek/ml).
- W przypadku innych grzybów należy przeprowadzić test ze znanym lekiem przeciwgrzybiczym, którego stężenie będzie idealne dla danego badania w odniesieniu do czasu inkubacji. Weź pod uwagę metabolizm i czas duplikacji grzyba.
3. Peptydy (nieznany czynnik)
- Przechowuj liofilizowane peptydy w temperaturze -20 °C i rozpuszczaj je w wodzie dejonizowanej przed każdym eksperymentem. Maksymalny czas przechowywania po rozpuszczeniu w wodzie będzie zależał od charakteru każdego peptydu.
- Przygotować podwielokrotności dwukrotnie wyższe od najwyższego stężenia końcowego badanego w teście (2X). Najlepiej przygotować niewielką liczbę porcji z wystarczającą ilością peptydu do jednorazowego użycia, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania.
nuta: Wybór stężenia powinien opierać się na literaturze i właściwościach peptydu. Zaleca się rozpoczęcie seryjnych rozcieńczeń od około 100 μM peptydu, a następnie zmniejszanie lub zwiększanie tego zakresu stężeń w zależności od uzyskanych wyników.
4. Referencyjne leki przeciwgrzybicze (kontrole pozytywne)
- Dla osób rozcieńczonych w wodzie: przygotować 2X roztwór o najwyższym stężeniu w analizie (patrz sekcja 5: Test przeciwgrzybiczy dla etapów rozcieńczania).
- W przypadku szczepów C. albicans należy przygotować roztwór 128 μg/ml flukonazolu lub 128 μg/ml kaspofunginy. Stężenie w płytce dla obu wyniesie 64 μg/ml.
- W przypadku szczepów C. neoformans należy przygotować roztwór 32 μg/ml amfoterycyny B (roztwór rozpuszczalny w wodzie). Stężenie w płytce wyniesie 16 μg/ml.
UWAGA: Zwykle amfoterycyna B jest rozcieńczana w dimetylosulfotlenku (DMSO), ponieważ ten środek przeciwgrzybiczy jest słabo rozpuszczalny w wodzie. Jednak na rynku dostępne są rozpuszczalne w wodzie preparaty amfoterycyny B.
- W przypadku leków przeciwgrzybiczych rozcieńczonych w rozpuszczalniku organicznym: przygotuj 100-krotny roztwór podstawowy w DMSO, a następnie rozcieńcz go do 10-krotnego roztworu w wodzie do użycia.
nuta: Tak więc w studni końcowe stężenie DMSO nie przekroczy 1%. Studnia, w której grzyb będzie rósł w pożywce zawierającej 1% DMSO, ponieważ wymagana jest kontrola, biorąc pod uwagę, że niektóre grzyby nie tolerują dobrze tego stężenia rozpuszczalnika. Pamiętaj, że DMSO jest światłoczułe, dlatego przykryj płytkę folią lub umieść ją w ciemnej komorze na czas trwania inkubacji.
5. Test przeciwgrzybiczy
UWAGA: Testy przeciwgrzybicze in vitro są wykonywane na podstawie testu wrażliwości na mikrorozcieńczenie bulionu według wytycznych Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 z pewnymi modyfikacjami.
- Przygotować dwukrotne seryjne rozcieńczenie każdego peptydu i kontrolować działanie przeciwgrzybicze w 96-dołkowych mikropłytkach polistyrenowych do końcowej objętości 50 μl.
- Za pomocą pipety dodać 100 μl środka przeciwgrzybiczego/peptydu o stężeniu 2X najwyższego pożądanego stężenia końcowego w kolumnach 1-3, w wierszu A.
- Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 μl sterylnej wody do pozostałych studzienek, w rzędach od B do H.
- Usunąć 50 μl studzienek o najwyższym stężeniu (rząd A), przenieść do następnego dołka o następnym stężeniu (rząd B) i homogenizować.
- Powtarzaj powyższe kroki, aż studzienka będzie miała najniższe stężenie i wyrzuć 50 μl tej studzienki (rząd H). Pozostawić kolumny 11 i 12 (rzędy A, B, C) tylko z wodą do ślepej próby lub kontroli ujemnej/wzrostu.
- Dodać 50 μl 2X dostosowanego inokulum w pożywce RPMI-1640 do każdej studzienki (kolumny 1-3 plus kolumna 11 (ujemna/kontrola wzrostu)); końcowe stężenie dla C. albicans wyniesie 2 x 103 komórki/ml, a końcowe stężenie dla szczepów C. neoformans wyniesie 10-4 komórki/ml.
- Przygotować ślepą próbę kontrolną (50 μl wody + 50 μl 2X pożywki RPMI-1640 bez komórek) i kontrolę ujemną/wzrostu (50 μl wody + 50 μl dostosowanego inokulum 2X pożywki RPMI-1640 bez środka przeciwgrzybiczego) i załadować do płytki studzienki, jak opisano powyżej.
- Powtórzyć procedurę dla każdego badanego związku i wybranego środka przeciwgrzybiczego (kolumny 4-10).
nuta: Seryjne rozcieńczenia można wykonać pionowo, jak w eksperymencie poniżej, lub poziomo na płytce (tj. jeśli liczba rozcieńczeń danego związku/ekstraktu, który należy przebadać, wynosi osiem lub więcej).
- Jeśli związki, leki referencyjne lub którykolwiek z ich składników są światłoczułe, należy przeprowadzić test w ograniczonym świetle, przykryć płytki folią lub umieścić w ciemnej komorze podczas inkubacji.
- Rozważ następujące opcjonalne zalecenia.
- Uszczelnij płytę przezroczystą pokrywą, która umożliwia wymianę gazu, ponieważ pomaga to zmniejszyć parowanie.
- Umieść płytkę w wilgotnej komorze, co również pomoże zmniejszyć parowanie.
- Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny lub 48 godzin w przypadku wszystkich szczepów C. albicans i przez 48 godzin z otrząsaniem 200 obr./min w przypadku C. neoformans. Dolna objętość końcowa (100 μl) zapewnia, że nie dochodzi do rozlania.
nuta: Nie zaobserwowano istotnej różnicy między odczytami MIC po 24 i 48 godzinach dla szczepów C. albicans. Niemniej jednak odczyty po 48 godzinach są łatwiejsze do wizualizacji.
- Obserwuj wszystkie studzienki, za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego, przed okresem inkubacji i po nim, aby sprawdzić zmiany w morfologii, a także sprawdzić, czy nie ma oznak zanieczyszczenia.
nuta: Odczyty mogą być wykonane wizualnie i sfotografowane pod koniec eksperymentu. Przed każdym odczytem należy lekko zhomogenizować płytkę. Odczyty można również wykonać, mierząc jego OD przy 600 nm, jeśli nie obserwuje się zagęszczenia komórek lub filamentacji.
- Eksperymenty należy przeprowadzić co najmniej trzy razy w różnych terminach.
Tabela 1. Przygotowanie pożywki i odczynników.
| Średni | preparat |
| 2X Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 podłoże – 500 ml | 10,4 g RPMI-1640 (uzupełniony L-glutaminą i czerwienią fenolową; bez wodorowęglanu) |
| 330 mM Kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy (MOPS) |
| Dostosuj do pH 7,0 za pomocą NaOH |
| Sterylizacja przez filtrację (filtr 0,22 μM) |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) | 137 mM NaCl |
| 2,7 mM KCl |
| 10 mM na2HPO4 |
| 2 mM KH2PO4 |
| Autoklaw w temperaturze 121°C przez 15 minut. |
| Rosół z dekstrozy Sabouraud | 15 g proszku w 500 ml wody destylowanej. |
| Dostosuj do pH 7,0 za pomocą NaOH |
| Autoklaw w temperaturze 121°C przez 15 minut. |
| Agar z dekstrozą Sabouraud | 32,5 g proszku w 500 ml wody destylowanej. |
| Dostosuj do pH 7,0 za pomocą NaOH |
| Autoklaw w temperaturze 121°C przez 15 minut. |