$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Kwantyfikacja żywotności agregacji GC
- Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym bulionie (GCP, Tabela 1) uzupełnionym 4,2% roztworami NaHCO3 i 1% Kellogga. Użyj spektrofotometrii na długości fali 650 nm (OD 650 1 = ~1 x 109 CFU/ml) w celu określenia stężenia zawieszonych bakterii.
- Dostosuj stężenie GC do ~1 x 108 jtk/ml.
- Dodać 99 μl dostosowanej zawiesiny GC do studzienek z 96-dołkową płytką.
- Inkubować płytkę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 , aby umożliwić agregację bakterii.
- Dodać 1 μl seryjnie rozcieńczonego ceftriaksonu (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5, 0,8, 0,4, 0,2 μg/ml) do każdego dołka. Pozostaw niektóre studzienki niepoddane obróbce, aby służyły jako kontrole.
- Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Sonikować zawiesinę 3 razy w każdej studzience przez 5 s przy 144 W i 20 kHz.
- Dodać 100 μl dostępnego w handlu odczynnika jarzeniowego do wykorzystania ATP do każdej studzienki, pipetować w górę i w dół 3 razy i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Ostrożnie przenieść 150 μl mieszaniny z każdej studzienki do nowej studzienki na 96-dołkowej czarnej mikropłytce i unikać wprowadzania pęcherzyków.
- Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 560 nm za pomocą czytnika płytek.
- Obliczyć współczynnik przeżycia na podstawie stosunku odczytu uzyskanego po seryjnym leczeniu ceftriaksonem do odczytu z nieleczonych studzienek.
2. Mikroskopowa analiza fluorescencyjna żywych/martwych agregatów GC
- Pobrać GC za pomocą sterylnego aplikatora. Wymaz GC z płytki i ponownie zawiesić GC we wstępnie podgrzanym podłożu GCP plus 1% suplementy Kellogga.
- Określić liczbę bakterii za pomocą spektrofotometrii przy długości fali 650 nm i dostosować stężenie GC do ~1 x 107 CFU/ml.
- Dodać 198 μl zawiesiny GC do 8-dołkowych komór z dnem szkiełka nakrywkowego.
- Inkubować komorę przez 6 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO2 w celu umożliwienia agregacji.
- Dodać 2 μl ceftriaksonu (100 μg/ml lub różne rozcieńczenia) do każdego dołka w każdym stanie agregacji. Inkubować przez żądany czas w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Dodać 0,6 μl mieszaniny żywego/martwego roztworu barwiącego do każdej studzienki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Rejestruj obrazy serii Z za pomocą mikroskopu konfokalnego (można użyć równoważnego mikroskopu).
- Analizuj obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ do pomiaru wielkości agregatów GC i stosunku intensywności fluorescencji FIR barwienia żywego do martwego w każdym agregacie.
Tabela 1: Przepis na 1 l pożywki do hodowli bakterii GCP.
