Określanie roli komórek neutrofilopodobnych we wrażliwości komórek chłoniaka na badany lek

Streszczenie

Źródło: Hirz, T., et al. Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film pokazuje test badający rolę komórek podobnych do neutrofili w ochronie komórek chłoniaka przed cytotoksycznością środków chemioterapeutycznych. Powstaje kokultura 3D, składająca się z chłoniaka i komórek podobnych do neutrofili, i wystawia się ją na działanie winkrystyny - leku stosowanego w chemioterapii. Bezpośredni kontakt z komórkami podobnymi do neutrofili indukuje regulację w górę białek antyapoptotycznych w komórkach chłoniaka, sprzyjając w ten sposób ich przetrwaniu w obecności winkrystyny.

Protokół

1. Różnicowanie komórek HL60 wzdłuż szlaku granulocytarnego i ich kokultura z komórkami B chłoniaka RL w modelu 3D

1. Różnicowanie ludzkich komórek promielocytarnych (HL60) w komórki podobne do neutrofili
   1. Dostosuj liczbę komórek HL60 do 3 x 10⁵ komórek / ml, a następnie dodaj 1 μM kwas retinowy (RA) i 1,25% DMSO, aby wywołać ich różnicowanie. Wysiewać każdą 3 x 10⁵ komórek HL60 na basenik na płytce 48-dołkowej, a następnie inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   2. Później zebrać komórki i odwirować przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki z pełną pożywką RPMI w celu zliczenia za pomocą licznika żywotności komórek.
   3. Następnie rozcieńczyć zawiesinę komórek w pełnej pożywce RPMI, aby dostosować liczbę komórek HL60 do 3 x 10⁵ komórek/ml i ponownie wywołać ich różnicowanie poprzez dodanie 1 μM kwasu retinowego (RA) i 1,25% dimetylosulfotlenku (DMSO). Wysiewać każde 3 x 10⁵ komórek HL60 na basenik na 48-dołkowej płytce i inkubować przez kolejne 48 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Analiza różnicowania HL60 (HL60 diff)
   1. Zebrać komórki i odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad z kompletną pożywką Roswell Park Memorial Institute (RPMI) w celu zliczenia za pomocą licznika żywotności komórek.
   2. Analiza zmian w ekspresji markerów powierzchniowych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Umieścić każde 3 x 10⁵ niezróżnicowanych komórek HL60 (z hodowli komórkowych) i 3 x 10⁵ komórekróżnicowych HL60 w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml do analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Zawiesić granulki w 50 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) - płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (4%). Oznacz komórki anty-ludzkim CD11b sprzężonym z AF700 lub anty-ludzkim CD38 sprzężonym z APC (5 μl / 10⁶ komórek). Inkubować komórki w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 ^oC.
   4. Przemyć 500 μl PBS-FBS (4%), a następnie odwirować przy 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić granulki w 200 μl PBS-FBS (4%).
   5. Analiza na cytometrze przepływowym przy użyciu strategii bramkowania przedstawionej na rysunku 1A i następującej konfiguracji optycznej: laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP); laser 633 nm: APC (660/20 BP), Alexa Fluor 700 (730/45 BP).
   6. Aby przetestować zmiany morfologiczne w HL60diff, unieruchomij komórki na szkiełkach do badania mikroskopowego.
      1. W tym celu należy ponownie zawiesić każde 3 x 10⁴ niezróżnicowane komórki HL60 (z hodowli komórkowej) i 3 x 10⁴ HL60 diff w 150 μl kompletnej pożywki RPMI. Zmontuj szkiełka szklane, karty filtracyjne i komory na próbki w wirówce cytospinowej, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona.
      2. Umieścić każdy typ komórki w komorze na próbkę i cytowirówce z prędkością 1 500 obr./min na 10 minut w temperaturze suchej smo. Wyjmij szkiełka, karty filtracyjne i komory na próbki z wirówki. Zdemontuj ostrożnie, aby nie uszkodzić komórek na suwaku. Wyrzuć karty filtracyjne i komory na próbki.
      3. Zabarwić komórki za pomocą zestawu do barwienia Giemsa i przechowywać szkiełka przez 1 godzinę do wyschnięcia. Zbadaj komórki pod mikroskopem ze 100-krotnym powiększeniem.
3. Kultura trójwymiarowa (3D)
   nuta: Upewnij się, że materiały użyte w tym eksperymencie są zimne, a eksperyment odbywa się na lodzie.
   1. Zawiesić każde 5 x 10⁴ komórek RL, samodzielnie lub zmieszanych z HL60diff w stosunku RL:HL60diff 1:10, z 300 μl macierzy błony podstawnej za pomocą 1 ml końcówki pipety przeciętej sterylnymi nożyczkami w celu poszerzenia otworu do około 2 do 3 mm. Na tym etapie unikaj pęcherzyków powietrza.
   2. Wysiewaj każde 300 μl zawiesiny komórek/dołka na płytce 24-dołkowej. Na tym etapie unikaj bąbelków. Inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ , następnie dodać 1 ml pełnej pożywki RPMI do każdego dołka i inkubować przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Zmieniaj podłoże co dwa dni. Dodać 10 nM winkrystyny w 5 dniu.
4. Analiza FACS
   1. Po 7 dniach hodowli odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć każdą studzienkę 1 ml lodowatego PBS. Dodać 3 ml/studzienkę lodowatego kwasu PBS-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (5 mM). Oderwij żel od dna studzienki, zeskrobując go za pomocą dna końcówki pipety o pojemności 200 μl. Delikatnie potrząsaj talerzem na lodzie przez 30 minut.
   2. Przenieść zawiesinę komórkową do sterylnej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie wstrząsnąć probówkami na lodzie przez kolejne 30 minut. Sprawdzić, czy nie ma jednorodnej zawiesiny komórek. (Jeśli tak nie jest, potrząsaj komórkami przez dłuższy czas lub dodaj więcej PBS-EDTA).
   3. Odwirować probówki przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć granulki za pomocą PBS, a następnie odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Zawiesić za pomocą PBS-FBS (4%) i znakować przeciwciałem anty-ludzkim CD19 sprzężonym z PE-Cy7 i przeciwciałem anty-ludzkim CD38 skoniugowanym z APC (5 μl / 10⁶ komórek). Inkubować w ciemności przez 30 minut w temperaturze 4 ^oC.
   5. Przemyć 500 μl PBS-FBS (4%), a następnie odwirować probówki o masie 300 g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki z Aneksyną V i PI za pomocą dostępnego w handlu zestawu.
   6. Analizę na cytometrze przepływowym przy użyciu strategii bramkowania przedstawionej na rysunku 2A i następującej konfiguracji optycznej: laser 488 nm: FSC-A (488 nM), SSC-A (488/10BP), FITC (530/30 BP), PI (610/20 BP), PE-Cy7 (780/60 BP); laser 633 nm: APC (660/20 BP). Upewnij się, że kompensacja kolorów.

Wyniki

Rysunek 1. Parametry strukturalne zróżnicowanych komórek HL60. (A) Wykresy rozproszenia do przodu (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC) reprezentują HL60 i zróżnicowane komórki HL60 (różnica HL60). (B) Komórkiróżnicowe HL60 i HL60 znakowano anty-CD11b-AF700 lub anty-CD38-APC, a następnie przeprowadzono analizę cytometrii przepływowej. Po bramkowaniu ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Silnik RPMI 1640	Gibco Invitrogen	Numer katalogowy 21875-034
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Gibco Invitrogen	Numer katalogowy: 10270-106
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS zawiera wapń i magnez)	Gibco Invitrogen	Numer katalogowy: 14040-091
Winkrystyna	EG labo
Matryca błony podstawnej BD Matrigel	BD Nauki biologiczne	354234	Umieścić w temperaturze 4 oC na noc przed dniem eksperymentu
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8418
Kwas retinowy	Sigma-Aldrich	Czynnik R2625
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)	Sigma-Aldrich	E5134
Zestaw do barwienia V-FLOUS	Roche	11 988 549 001
Zestaw RAL 555 Zmodyfikowany zestaw do barwienia Giemsa	Kosmos Biomedyczny	CB361550-0000
Cytometria przepływowa LSRII	BD Nauki biologiczne
Cytowirówka	Thermo Scientific
Mikroskop Leica DMR-XA	Mikrosystemy Leica
Celometr Automatyczny licznik żywotności komórek T4	Nexcelom Bioscience

powiedział: